淫羊藿苷对EAE模型鼠的治疗作用及其对HPA轴的影响

发布时间：2017-10-03 01:05

  本文关键词：淫羊藿苷对EAE模型鼠的治疗作用及其对HPA轴的影响

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【摘要】：背景： 多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种常见的中枢神经系统白质脱髓鞘性疾病。其症状复杂，多呈反复发作、进行性加重、高致残率等特点。大剂量甲泼尼松龙（methyl prednisolone,MP）等对缓解症状有明显疗效，但目前尚无公认有效的可以阻止复发进展的治疗药物，且大剂量糖皮质激素（glucocorticoid,GC）可导致骨质疏松、股骨头坏死、上消化道出血等严重不良反应。国内外研究证实MS多发于女性，且复发进展与雌激素水平密切相关，补充雌激素有益于病情复发的控制，且对GC具有正性调节作用，但存在引发肿瘤、降低免疫力、血栓性疾病的风险。因此，本研究以雌激素作用途径为切入点，选择雌激素和确认具有雌激素作用的淫羊藿苷（Icraiin,ICA）为治疗药物，通过对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE）模型神经损害、病理、细胞因子、激素水平以及相关受体蛋白的表达，探讨药物的疗效差异及剂量相关性，以及疗效与下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）轴的关系。 目的： 构建MS的实验动物模型—EAE小鼠模型，，通过雌激素、雌激素受体抑制剂及不同剂量的有雌激素样作用的ICA对EAE小鼠的治疗，从临床症状评分、免疫机制相关的细胞因子、组织病理学改变等方面探讨ICA对EAE的治疗作用及量效关系；从外周血、靶器官、中枢等方面的分子水平、蛋白水平等多层面分析不同剂量ICA对HPA轴相关激素表达水平的影响；通过对不同剂量ICA作用下内源性雌激素水平的检测，研究ICA雌激素样作用；并且通过对ER拮抗剂组与其他组别对比，研究ICA对EAE的治疗作用，并探讨这种治疗作用和HPA轴的激活的关联性。为植物雌激素治疗MS及新药的开发奠定实验基础。 方法： 1、将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽（myelin oligodendrocyteglycoprotein,MOG35-55）稀释成600ug/ml，然后稀释液与等量的完全弗氏佐剂（completefreund’s adjuvant,CFA）（灭火结核分枝杆菌的终浓度为5mg/ml）混合作为抗原，接种于C57BL/6小鼠双侧侧腹壁及脊柱两侧皮下（分四点，每部位50ul），免疫后第7d加强免疫1次（等剂量MOG/CFA）。在免疫后第0及48h腹腔内注射500ng百日咳毒素，诱导小鼠EAE模型。 2、将EAE发病小鼠按神经损伤症状评分随机分成8组，每组至少6只。分别分为A组急性组，在发病高峰期处死；B为模型对照组，让其按自然病程发展；C为雌激素组，予以己烯雌酚0.2mg/kg.d灌胃；D为ICA大剂量组，予以ICA300mg/kg.d灌胃；E为ICA中剂量组，予以ICA150mg/kg.d灌胃；F为ICA小剂量组，给予50mg/kg.d灌胃；G为ICA加ICI182,780组，给予ICA150mg/kg.d灌胃加ICI182,7801mg/mouse.d皮下注射，M为空白对照组，给予模型鼠等容量0.5％羧甲基纤维素钠混悬液灌胃；N为正常对照组，予等容量0.5％羧甲基纤维素钠混悬液灌胃。免疫接种后第9天开始陆续发病，第14天左右达到发病高峰期开始给药，连续给药5天。于免疫前一天开始每天称重，并于免疫第9天开始观察小鼠神经系统症状并评分，根据评分情况进行分组，给药。约14天时将急性组处死取材，于19天左右将灌胃各组处死，约40天时将模型对照组（B组）处死，采集血标本及脑、脊髓等组织标本。 3、取小鼠脊髓腰膨大进行HE染色，用Luxol Fast Blue（LFB）法髓鞘染色；用3’末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记法（Terminaldeoxynucleotidylteansferac-mediated Oridine3’-Tri-phosphatebiotinNick End Labeling,TUNEL）观察脊髓组织的细胞凋亡情况；对脑组织进行匀浆，提取蛋白，用蛋白印迹法（Western-blot，WB）检测脑组织中糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）的表达情况。 4、采血并以酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清中白细胞介质-17A（interleukin-17,IL-17A）含量。并用放射免疫法测定血清中皮质酮（corticosterone,CORT）的含量。 5、对药物治疗各组小鼠和模型组、空白对照组小鼠进行临床症状评分、体重称量、炎性病灶凋亡细胞计数、细胞因子含量、激素含量等进行综合分析，评估比较不同剂量ICA与雌激素对EAE的疗效，以及ER拮抗剂对ICA疗效的影响。并对各组小鼠的疗效和GR表达进行相关性分析。 结果: 1、建立的EAE模型小鼠，所表现出的神经功能损害症状、HE染色、脊髓腰膨大处的髓鞘染色，均符合典型EAE模型的病理和临床特征，模型对照组（B组）有缓解-复发现象。 2、雌激素组（C组）、ICA大剂量组（D组）、ICA中剂量组（E组），治疗后体重均比治疗前增加，但无统计学意义。ICA小剂量组（F组）体重明显减轻且差异有统计学意义，P＜0.01；中剂量ICA+ICI组（G组）治疗后体重也有减轻，但P＞0.05;治疗后临床症状评分B、C、D、E各组都有下降，以C组和D组下降最为明显，ICA小剂量组（F组）评分均值保持基本不变，D组和F组评分比较差异明显，P＜0.01。空白对照组（M组）和G组症状评分则升高。 3、脊髓细胞凋亡图片观察到一些现象，神经细胞凋亡数目排列顺序依次为：模型对照组（B组）＞ICA小剂量组（F组）＞ICA大剂量组（D组）＞正常对照组（N组），但因样本数目过少，无法统计。 4、 IL-17A的水平：与正常组相比各模型组都有升高，以A、B、G升高具有显著差异，P＜0.05；而C、D两组较A、B、G三组比均明显降低，且C组比G组降低更为明显，且P＜0.05，差异有统计学意义。而E组和G组比，虽有降低，但差异无统计学意义。IL-17A浓度和治疗前后评分差值呈负相关(r=-0.8581，P=0.0288）。 5、同样临床症状缓解明显的C组和D组，CORT水平却差异甚大。和正常对照组比较C组升高，而D组则下降，C组和D组比较，P＜0.0001。D组CORT水平和IL-17A水平呈单向正相关（r=0.812，P=0.0496）。 6、脑组织中GR蛋白表达水平：与正常对照N组比较，A、B、C、D、E、M各组都有升高，以B、C、D、M各组升高更为显著，P＜0.01；与M组（空白对照组）相比，除G组降低之外其余平均值都升高，但仅C组升高较明显，P＜0.05；G组和E组比较有所降低，但无统计学差异。以上各统计数据均以双侧P＜0.05为有统计学意义。 结论： 1、 ICA对EAE模型鼠的神经损害具有改善作用，且呈一定的剂量依赖性。ER拮抗剂可使ICA的治疗作用减弱。 2、大剂量ICA对炎性细胞因子IL-17A具有降低作用，表明大剂量的ICA具有明显的抗炎作用。 3、 ICA可增高脑组织GR的表达，但模型鼠血CORT含量降低，表明其可能具有促进HPA轴的功能，提示其在临床应用中一定剂量的ICA与糖皮质激素治疗可能具有协同作用。 4、 ICA治疗作用可能机制是与ER结合，其拟雌激素样作用直接发挥抗炎作用；或是通过促进HPA轴的功能，从而增强机体抗炎和免疫抑制功能。
【关键词】：EAE模型 淫羊藿苷 雌激素 糖皮质激素受体 炎性细胞因子
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R744.51
【目录】：

• 中英文缩略语对照6-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 引言17-19
• 第一部分 EAE 模型建立19-31
• 1 材料与方法19-23
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-23
• 2 结果23-28
• 2.1 EAE 小鼠发病情况23-24
• 2.2 EAE 小鼠病理学改变情况24-27
• 2.3 小鼠神经功能评分27-28
• 2.4 小鼠体重变化28
• 3 讨论28-31
• 第二部分 雌激素、ICA 治疗 EAE 的疗效及关联性分析31-54
• 1 材料与方法32-35
• 1.1 材料32-33
• 1.2 方法33-35
• 2 结果35-46
• 2.1 临床评分及体重变化比较35-40
• 2.2 脊髓腰膨大细胞凋亡数目趋势比较40-41
• 2.3 血清中细胞因子 IL-17A 水平的检测41-42
• 2.4 放射免疫法检测各组小鼠血清中 CORT 水平42-43
• 2.5 各组小鼠脑组织中 GR 蛋白表达的检测43-45
• 2.6 影响疗效的各因素间相关性的探讨45-46
• 3 讨论46-54
• 3.1 雌激素对 MS 的治疗作用46-48
• 3.2 ICA 对 EAE 模型鼠治疗效果的影响48-49
• 3.3 ICA 对 HPA 轴的影响49-52
• 3.4 ICA 对 EAE 免疫相关细胞因子的影响52-54
• 全文总结54
• 参考文献54-60
• 攻读学位期间发表论文60-61
• 文献综述一61-68
• 参考文献66-68
• 文献综述二68-73
• 参考文献71-73
• 致谢73-74

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本文编号：962260