人DSPP启动子的分析及细胞牙向分化报告体系的建立

发布时间：2017-10-03 05:48

  本文关键词：人DSPP启动子的分析及细胞牙向分化报告体系的建立

  更多相关文章： DSPP 启动子 人牙胚间充质细胞 地塞米松 双荧光素酶 LacZ

【摘要】：牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达是细胞向成牙本质细胞分化的标志。传统检测DSPP表达的方法有RT-PCR、免疫组化、Westem-Blot等,这些方法操作耗时费力,且大多不能进行定位分析。小鼠中已有基于Dspp启动子构建的重组报告基因检测Dspp表达的系统,人类DSPP启动子的研究还未见相关报道,因此,本研究试图分析人DSPP启动子的结构以及基于启动子结构基础上构建hDSPP promoter-LacZ报告体系,从而快速定位检测细胞是否向成牙本质细胞分化。 DSPP基因表达属于诱导表达,因此,本研究首先建立细胞表达DSPP的体系,主要是通过使用含地塞米松(Dexamethasone)的诱导培养液来诱导人牙间充质细胞向成牙本质细胞分化；通过Real time.PCR分析,人牙间充质细胞经诱导培养液培养后,其DSPP的表达量明显上升,说明使用地塞米松诱导培养液能够在体外诱导牙源性干细胞向成牙本质细胞分化。其次是人DSPP启动子结构的初步分析,主要是先通过在线软件(TESS和Genomatix Software Suite)分析人DSPP启动子拟区域序列-4000—+54的特征,包括启动子的基本元件和顺式作用元件的潜在分析；根据软件分析结果设计引物克隆人DSPP启动子拟区域的不同序列,分别是-4000—+54、-2500—+54、-1447—-+54、1027—+54,并将它们分别插入到荧光素酶报告载体pGL3-Basic上,构建包含DSPP启动子和荧光素酶报告基因的重组质粒pGL3-LUC-hDSPP promoter,用脂质体转染法将pGL3-LUC-hDSPP promoter和内参质粒CMV-Renilla共转染至人牙胚间充质细胞中,地塞米松诱导培养液培养48-72h后,双荧光素酶报告检测DSPP启动子的活性,结果发现构建的人DSPP启动子拟序列中-2500—+54区域的活性最高,其次是-1447——+54。最后,根据启动子活性测定结果,用-2500——+54区域的序列构建phDSPP(-2500-+54)-LacZ漫病毒报告载体；用phDSPP (-2500-+54)-LacZ慢病毒感染人牙胚间充质细胞,诱导培养后用X-Gal染色,结果与感染空载慢病毒的细胞相比,感染phDSPP(-2500-+54)-LacZ慢病毒的细胞部分区域呈蓝色,说明phDSPP(-2500-+54)-LacZ报告系统可用于检测体外细胞DSPP表达。 hDSPP启动子的分析及其报告体系的建立有利于种子细胞牙向分化的快速检测以及牙发育过程中生长因子和转录因子作用的研究。
【关键词】：DSPP 启动子 人牙胚间充质细胞 地塞米松 双荧光素酶 LacZ
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-7
• 目录7-10
• 绪论10-20
• 一、哺乳动物牙齿发育10-11
• 二、干细胞向成牙本质细胞分化的研究11-14
• (一) 干细胞与牙齿再生的研究进展11-13
• (二) 诱导牙源性干细胞向成牙本质细胞分化的研究13-14
• 三、真核生物启动子结构14-15
• 四、外源基因导入细胞常用的方法15-17
• 五、研究目的和意义17-20
• 第一章 材料与方法20-42
• 1.1 实验材料20-24
• 1.1.1 实验仪器与耗材20
• 1.1.2 菌株、载体与细胞20-21
• 1.1.3 实验试剂21
• 1.1.4 实验试剂配制21-24
• 1.1.5 引物24
• 1.2 实验方法24-42
• 1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备24-25
• 1.2.2 DNA提取25-26
• 1.2.3 PCR基因扩增26-29
• 1.2.4 限制性内切酶酶切29
• 1.2.5 电泳及割胶纯化29-30
• 1.2.6 末端去磷酸化和连接反应30-31
• 1.2.7 质粒或连接产物转化31
• 1.2.8 转化子的鉴定31-32
• 1.2.9 细胞的复苏、传代、扩大培养及冻存32-33
• 1.2.10 诱导hEDMC/ihEDMC细胞表达DSPP33
• 1.2.11 细胞总RNA的提取33-34
• 1.2.12 Real-time PCR反应34-35
• 1.2.13 双荧光素酶报告系统检测启动子活性35-36
• 1.2.14 磷酸钙沉淀法转染293T细胞,生产慢病毒36-38
• 1.2.15 慢病毒浓缩与滴度测定38-39
• 1.2.16 慢病毒感染hEDMC/ihEDMC4细胞(以6cm培养皿为例)39
• 1.2.17 细胞X-Gal染色39-42
• 第二章 结果42-66
• 2.1 细胞表达DSPP体系的建立42-43
• 2.2 DSPP启动子有效序列位置的确定43-56
• 2.2.1 软件分析DSPP启动子拟序列的结构特征43-44
• 2.2.2 pGL3-LUC-DSPP promoter载体的构建44-53
• 2.2.3 hDSPP启动子拟序列活性检测(双荧光素酶报告系统检测法)53-56
• 2.3 人DSPP启动子报告载体构建及其用于牙向分化检测的可行性分析56-66
• 2.3.1 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ载体的构建56-60
• 2.3.2 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ慢病毒的生产及滴度测定60-62
• 2.3.3 phDSPP((-2500-+54))-LacZ报告载体用于牙向分化检测的可行性分析62-66
• 第三章 分析与讨论66-70
• 3.1 细胞表达DSPP体系的建立66-67
• 3.2 DSPP启动子有效序列位置的确定67-69
• 3.2.1 pGL3-Basic-DSPP promoter载体的构建67-68
• 3.2.2 启动子活性检测68-69
• 3.3 DSPP promoter报告体系的建立及可行性分析69-70
• 3.3.1 慢病毒包装生产69
• 3.3.2 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ用于细胞牙向分化检测的可行性分析69-70
• 第四章 实验结论70-72
• 参考文献72-78
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果78-80
• 致谢80-82
• 个人简历82-84

【共引文献】

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本文编号：963499