牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗原的基因克

发布时间：2017-10-03 11:02

  本文关键词：牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗原的基因克隆、表达和抗原性鉴定

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【摘要】：快速、准确的检测是防控和净化牛布病和结核病（以下称“牛两病”）的前提，为了减少以扑杀的方式来消除牛两病的流行，加强牛两病疫情监测及防治工作，通过市场提供安全、廉价、敏感、特异的多种牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组抗原，本研究拟克隆牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌抗原基因，构建重组原核表达质粒，并建行了重组抗原鉴定，，为牛血清中布鲁氏菌抗体和结核杆菌抗体的检测提供有价值的抗原，为我国牛两病的诊断试剂的研发奠定基础。主要完成以下三个方面的研究工作： 1、利用PCR技术和基因工程技术，成功克隆了牛布鲁氏菌BCSP31、BP26、Cu-Zn SOD、DnaK、L7/L12、OMP17.3、P39和牛分枝杆菌Ag85B、CFP10、ESAT-6、HBHA、MPB63、MPB70、MPB83共14个抗原基因，并成功构建了这14个抗原基因的重组原核表达质粒。经过测序鉴定，克隆的这14个抗原基因与预期克隆的目的基因在核苷酸序列及氨基酸序列上都具有高度的同源性，达99.3%以上。 2、将14个抗原基因的重组原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌进行原核表达，然后利用Ni柱亲和层析法、电洗脱法等对表达产物进行纯化。结果得到大部分纯度90%以上、浓度在1.0~2.0mg/mL的重组抗原。 3、通过建立的用于鉴定重组抗原抗原性的间接ELISA法，证明了本研究纯化的牛布鲁氏菌rBP26、rDnaK、rOMP17.3和牛分枝杆菌rAg85B、rCFP10、rESAT-6、rHBHA、rMPB70、rMPB83具有良好的抗原性，适于作为候选的诊断抗原，为牛血清中布鲁氏菌抗体和结核杆菌抗体的检测提供有价值的抗原。
【关键词】：牛布鲁氏菌 牛分枝杆菌 间接ELISA
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911;R378.5;Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-16
• 1 布病与结核病的概述7-8
• 1.1 布病病原7
• 1.2 结核病病原7-8
• 1.3 流行特点8
• 2 布病与结核病的疫情8-10
• 2.1 布病疫情9
• 2.2 结核病疫情9-10
• 3 布病与结核病的诊断方法10-14
• 3.1 细菌学检查10-11
• 3.2 免疫学检验11-13
• 3.3 分子生物学检测13-14
• 4 本论文的目的意义14-16
• 第二章 牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌几种特异性诊断抗原基因的克隆16-39
• 1 材料17-19
• 1.1 菌种、基因组 DNA 与质粒17
• 1.2 试剂17-18
• 1.3 主要仪器设备18-19
• 2 方法19-26
• 2.1 引物设计与合成19-20
• 2.2 目的基因的 PCR 扩增20-21
• 2.3 PCR 产物的鉴定及纯化21
• 2.4 牛布鲁氏菌目的基因的 TA 克隆21-24
• 2.5 牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组原核表达质粒的构建24-26
• 2.6 牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组原核表达质粒的鉴定26
• 3 结果与分析26-34
• 3.1 目的基因的 PCR 扩增26-27
• 3.2 牛布鲁氏菌目的基因阳性 TA 克隆的筛选与鉴定27-30
• 3.3 牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组原核表达质粒的构建30-34
• 4 讨论34-38
• 4.1 目的基因的选择34-37
• 4.2 菌株模板 DNA 的选择37
• 4.3 重组原核表达质粒的构建37-38
• 5 本章小结38-39
• 第三章 牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌重组抗原的表达、纯化和抗原性鉴定39-69
• 1 材料39-41
• 1.1 菌种与质粒39
• 1.2 血清39
• 1.3 试剂39-40
• 1.4 主要仪器设备40-41
• 2 方法41-49
• 2.1 重组原核表达菌的构建41
• 2.2 小量诱导与优势表达菌种的筛选41-42
• 2.3 重组抗原的大量表达42-43
• 2.4 重组抗原的纯化43-46
• 2.5 重组抗原的纯度与浓度测定46-47
• 2.6 重组抗原的抗原性鉴定47-49
• 3 结果与分析49-65
• 3.1 小量诱导与优势表达菌种的筛选49-54
• 3.2 重组抗原的大量表达54-60
• 3.3 重组抗原的纯度与浓度测定60
• 3.4 牛布鲁氏菌重组抗原间接 ELISA 反应条件的确定60-62
• 3.5 牛布鲁氏菌重组抗原的抗原性鉴定62-64
• 3.6 牛分枝杆菌重组抗原的抗原性鉴定64-65
• 4 讨论65-67
• 4.1 关于原核表达载体的选择65-66
• 4.2 关于重组抗原的表达66
• 4.3 关于重组抗原的纯化66
• 4.4 关于重组抗原的抗原性鉴定66-67
• 5 本章小结67-69
• 第四章 全文结论69-70
• 参考文献70-76
• 附录76-94
• 一、本论文中的部分英文缩略词76-78
• 二、载体质粒的图谱信息78-80
• 三、部分实验试剂的配制80-84
• 四、基因测序序列84-94
• 在校期间发表论文清单94-95
• 致谢95

【参考文献】

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本文编号：964815