全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗体制备及活性鉴定

发布时间：2017-10-04 06:15

  本文关键词：全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv中和抗体制备及活性鉴定

  更多相关文章： 狂犬病病毒糖蛋白 免疫型噬菌体抗体库 噬菌体抗体 单链抗体 中和抗体

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患疾病，几乎遍及全世界各个国家。狂犬病一旦发病尚无有效治疗措施，，死亡率几乎为100%[1]。由于狂犬病的传染源广泛存在，全球每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，并且每年至少有1650万人需要接受狂犬病病毒暴露后治疗，疾病控制难度很大。我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，仅次于印度，居全球第二位。据保守估计，我国每年超过3000人死于狂犬病，并且近几年发病率呈现逐年上升的趋势。因此研制有效的狂犬病防治药物具有重要意义[2]。 世界卫生组织（WHO）建议，对狂犬病的III级暴露及免疫力低下患者的II级暴露治疗，必须立即接种狂犬病疫苗和抗狂犬病病毒免疫球蛋白（RIG）。目前，临床上使用的RIG包括马抗狂犬病病毒免疫球蛋白（ERIG）和人抗狂犬病病毒免疫球蛋白（HRIG）两类。ERIG易引起过敏反应和血清病；HRIG成本高且产量少，存在潜在病毒污染的危险；血源产品质量难以控制，临床使用存在安全隐患，难以满足临床用药需求，其治疗效果也有待于提高[3,4]。因此，研发全人源基因工程抗体替代传统的血源性免疫球蛋白已迫在眉睫。 本研究应用噬菌体抗体库技术，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库，从中富集、筛选具有中和活性的全人源抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体，为研制可用于人狂犬病病毒暴露后的紧急预防药物奠定基础。 研究方法 1.构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库 取130位经狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞，提取总RNA，逆转录制备cDNA；用人源特异性抗体引物扩增VH、VL基因，再经过重叠PCR制备scFv基因片断；将scFv片断与pComb3XSS同时经SfiI酶切、纯化并连接后电转化入宿主菌E.coli.XL1-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养后，上清经PEG8000/NaCl沉淀，构建抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。 2. E.coli.TOP10F′原核表达系统表达并纯化狂犬病病毒G蛋白（RVG） 以逆转录制备的cDNA为模板，扩增RVG基因，PCR产物胶回收纯化，经酶切与重组质粒pColdⅡ连接，连接产物测序正确后进一步转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定，His-Trap HP镍亲和柱纯化狂犬病病毒G蛋白，SDS-PAGE电泳及质谱鉴定。 3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选、表达及中和活性鉴定 以纯化的狂犬病病毒G蛋白包被ELISA板，将构建的抗体库进行“吸附-洗脱-富集”，从筛选得到的细菌集落中随机挑选单克隆，phage-ELISA鉴定。阳性克隆经序列分析后，进行表达、纯化和结合活性的初步鉴定；ELISA、荧光抗体中和试验等对表达产物进行生物学活性鉴定。 研究结果 1.构建全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库：采用噬菌体展示技术，经over-lap PCR扩增得到scFv基因片段约750bp，电转化导入E.coli.XL1-Blue中，构建了库容为5.0107的全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。 2.狂犬病病毒G蛋白的表达：根据GenBank收录的狂犬病病毒G蛋白基因序列，设计特异性引物，以cDNA为模板扩增出RVG基因片段，扩增片段大小为1500bp，与预期相符；将扩增产物纯化与载体质粒pColdⅡ酶切后连接测序，测序正确后，转化E.coli.TOP10F′感受态细胞，诱导表达，Western Blot鉴定表明为目的蛋白，SDS-PAGE电泳显示纯化后蛋白分子量大小67KD。质谱鉴定结果证明所表达的蛋白为狂犬病病毒G蛋白（rabies virus strain CTN glycoproteinGI:11528007）。 3.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体的筛选及表达：以纯化的狂犬病病毒G蛋白为抗原进行了五轮富集筛选，从全人源scFv噬菌体抗体库中筛选抗狂犬病病毒抗体，每一轮筛选后噬菌体抗体收获率均有增加，第五轮筛选的噬菌体抗体收获率较第一轮提高了20倍；共获得4株核酸序列不同的scFv抗体，分别为scFv28、scFv70、scFv44、scFv42，初步检测后进行表达，纯化。 4.抗狂犬病病毒G蛋白特异性scFv抗体生物学活性鉴定：通过ELISA等方法对筛选出的抗体进行初步生物学活性分析，结果表明，4株scFv抗体均可与狂犬病病毒及G蛋白特异性结合；抗体中和试验结果证实，scFv42具有中和活性。 研究结论 1.成功构建了全人源抗狂犬病病毒噬菌体抗体库，库容为5.0107，为制备抗狂犬病病毒抗体奠定了基础。 2.通过原核表达体系表达并纯化了狂犬病病毒G蛋白，为筛选全人源抗狂犬病病毒G蛋白抗体提供了抗原。 3.筛选获得4株抗狂犬病病毒抗体，证明其中一株抗体scFv42具有中和活性，具有替代目前血源性免疫球蛋白用于狂犬病病毒暴露后治疗的潜能。
【关键词】：狂犬病病毒糖蛋白 免疫型噬菌体抗体库 噬菌体抗体 单链抗体 中和抗体
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.9;R392
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 研究一 全人源抗狂犬病病毒 scFv 噬菌体抗体库的构建14-31
• 摘要14
• 材料与方法14-26
• 结果26-29
• 讨论29-31
• 研究二 狂犬病病毒 G 蛋白表达、纯化及鉴定31-43
• 摘要31
• 材料与方法31-38
• 结果38-41
• 讨论41-43
• 研究三 抗狂犬病病毒 G 蛋白 scFv 抗体的筛选、表达及中和活性鉴定43-57
• 摘要43
• 材料与方法43-51
• 结果51-54
• 讨论54-57
• 小结57-58
• 参考文献58-61
• 附录一：scFv 基因序列61-64
• 附录二：文献综述64-78
• 参考文献73-78
• 附录三：缩略语78-79
• 附录四：在读期间发表的论文和参与的科研工作79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 张晓;曾晓燕;刘哲;金秋;徐言;冯振卿;焦永军;;H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究[J];生物化学与生物物理进展;2011年06期

2 马小兵;畅继武;;噬菌体抗体库技术[J];生物学通报;2005年10期

3 梁秀梅，于潜;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物学通报;1994年06期

4 闭兰,张爱华,彭祥兵,王志友,张智,余模松;从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体[J];中国生物制品学杂志;2004年02期

5 王晓虎;靳玉珠;丁壮;扈荣良;;治疗性狂犬病病毒单克隆抗体的研究进展[J];中国生物制品学杂志;2009年10期

本文编号：969067