临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药基因的检测及其与β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相关性研究

发布时间：2017-10-05 03:12

  本文关键词：临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药基因的检测及其与β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相关性研究

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【摘要】：目的 了解安徽地区2005~2010年临床分离的104株黏质沙雷菌耐药情况和染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药基因的种类、分布，为临床合理选择抗菌药物提供依据。 研究临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药基因与β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因的相关性。 材料与方法 菌株来源 104株黏质沙雷菌临床分离株来自安徽省细菌耐药监测中心2005年~2010年每年9月份收集的监测网所属34所医院(由皖南、皖中、皖北不同级别的医院组成)住院和门诊患者的各类临床标本。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，转移接合试验受体菌大肠埃希菌J53AZR为安徽省细菌耐药监控中心保存。 方法 1.采用琼脂倍比稀释法进行抗菌药物敏感性试验，药物敏感性试验质控菌采用E.coliATCC25922。 2.用煮沸法提取细菌总DNA，碱裂解法提取质粒；用聚合酶链反应(PCR)方法扩增染色体gyrA与parC基因和质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因；PCR产物纯化测序，结果与Genbank中基因序列进行比对，以明确gyrA与parC基因是否突变以及质粒介导喹诺酮类耐药基因的基因型。 3.用PMQR基因阳性菌株与大肠埃希菌J53AzR行转移接合试验；采用琼脂倍比稀释法对受体菌与接合子进行最低抑菌浓度(MIC)测定。 4.临床分离菌株的总DNA为模板，PCR方法扩增β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因；对PCR产物进行测序，结果与Genbank中基因序列进行比对，以明确基因型。然后用接合子的质粒DNA为模板，PCR扩增β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因，验证这些耐药基因是否同时发生转移。 结果 1.粘质沙雷菌在呼吸道痰标本中检出率最高，达59.6%；主要分布于呼吸内科、重症监护病房、老年病科等；药敏结果显示，粘质沙雷菌对1、2代头孢菌素表现出很高的耐药性，耐药率在79.8%-91.3%以上；对左氧氟沙星、加替沙星，4代头孢菌素比较敏感，敏感率在70%以上；未发现对亚胺培南、美罗培南耐药菌株；头孢西丁耐药株对大多数抗菌药物的耐药率均较高，且与非耐药株的药敏结果进行比较两者之间耐药性差异具有统计学意义（P0.05）。 2.104株黏质沙雷菌中检出6株携带qnr基因和(或)aac(6′)-Ib-cr基因，其中3株携带qnr基因；4株携带aac(6′)-Ib-cr基因(其中1株同时携带qnr基因)；未检测出qnrA、qnrC、qnrD及qepA基因。9株检测出gyrA基因突变，7株检测出parC基因突变。qnr基因：qnr基因阳性菌株经测序并与GenBank上的基因序列进行比对，确定2株qnrB基因阳性菌均为qnrB6亚型，1株qnrS基因阳性菌株为qnrS2亚型。qnrB6与qnrS2的GenBank注册号分别为JQ034317和JQ041635。aac(6′)-Ib-cr基因：4株经PCR产物电泳检测出现300bp左右的目的条带，为aac(6′)-Ib基因阳性菌株，PCR产物经测序确定为aac(6′)-Ib-cr，GenBank注册号为JQ034318。 gyrA与parC基因突变：9株gyrA阳性的菌株均有第83位氨基酸密码子突变，由TCG变为TTG，从而导致编码的氨基酸由Ser变为Leu，或同时有第87位氨基酸密码子由GAC变为AAC，从而导致编码的氨基酸由Asp变为Asn；7株parC阳性的菌株均有第80位氨基酸密码子突变，由AGC变为ATT，从而导致编码的氨基酸由Ser变为Ile，其中3株同时存在第57、129、131与134位氨基酸密码子突变。gyrA的GenBank注册号为JQ034320和JQ235843；parC的GenBank注册号为JQ034319和JQ235844。 3.6株携带qnr基因和(或)aac(6′)-Ib-cr基因的菌株中有5株转移接合成功，接合子经生化鉴定为大肠埃希菌。经PCR扩增及DNA测序分析证实，2株接合子(T22、T91)携带qnrB6基因；1株接合子(T64)携带qnrS2基因；3株接合子(T60、T86、T91)携带aac(6′)-Ib-cr基因。药敏结果表明，这5株接合子与受体菌相比，对环丙沙星的耐药率至少提高了8~32倍。 4.11株gyrA，parC突变株与qnr，aac(6′)-Ib-cr阳性株中，分别检测到SHV型3株，CTX-M型2株，OXA型4株和TEM型2株。测序结果经BLAST系统比对，分别为：blaSHV-5，blaCTX-M-14，blaOXA-1，blaTEM-1。检测到16S rRNA甲基化酶基因阳性株2株，，其测序结果经BLAST系统比对均为armA型。β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因可以联合PMQR基因同时发生水平转移。 结论 1.安徽地区黏质沙雷菌对多种抗菌药物耐药，且多重耐药现象严重，应加强细菌耐药监测。 2.证实了在安徽地区存在质粒介导的喹诺酮类耐药的黏质沙雷菌，也是国内第一次在黏质沙雷菌中检出qnr基因。 3.阳性菌株接合子对喹诺酮类抗菌药物的MIC和受体菌相比较有一定程度的提高。 4.黏质沙雷菌中已经出现了质粒介导的AmpC酶，且可以与质粒介导的喹诺酮耐药基因同时存在。 5.染色体及质粒介导的喹诺酮耐药基因常与β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶同时存在于同一株黏质沙雷菌中，导致多重耐药。
【关键词】：黏质沙雷菌 喹诺酮类 染色体 质粒 耐药性
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416;R446.5
【目录】：

• 目录4-6
• 缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一部分 安徽省部分医院临床分离的黏质沙雷菌耐药性分析及喹诺酮类耐药基因的检测13-35
• 前言13-14
• 材料与方法14-20
• 结果20-27
• 讨论27-30
• 结论30-32
• 参考文献32-35
• 第二部分 （临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药基因与β-内酰胺酶和 16S rRNA 甲基化酶基因的相关性研究）35-52
• 前言35-36
• 材料与方法36-41
• 结果41-46
• 讨论46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-52
• 附录52-55
• 个人简历52
• 硕士期间科研学习成果52-55
• 致谢55-56
• 综述56-67
• 参考文献62-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：974423