利用杆状病毒系统生产携带抗体表达基因的双链AAV的研究

发布时间：2017-10-07 06:13

  本文关键词：利用杆状病毒系统生产携带抗体表达基因的双链AAV的研究

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【摘要】：众所周知，单克隆抗体对于肿瘤疗效显著，，基因表达抗体的结果受所选用载体的影响较大，因此表达载体的选择在基因治疗肿瘤中起着至关重要的作用。多项临床研究表明，腺相关病毒（AAV）不仅能够有效地介导转基因的表达且无剂量限制性毒性，因此国内外研究中广泛采用腺相关病毒载体来作为基因治疗载体。常用的单链AAV载体具有致病原性低、宿主范围广、表达时间长等优点，但也存在一些不足，例如表达延迟、表达水平低等；而双链AAV由于越过了由单链转变为双链的过程从而克服了上述缺点。 双链AAV的基因组在缺失D序列后，通过自身基因组的折叠形成dsDNA而无需宿主细胞介导的DNA合成或多个载体间的互补配对，从而直接被包装成为携带双链基因组的AAV载体，因此起效时间更快，转导效率更高。经典的三质粒转染生产AAV具有繁琐复杂、费时费力、且难以大规模培养的缺点，杆状病毒生产系统以其高安全性、操作简单快捷、低成本、易于大规模培养等优势用于AAV载体的生产吸引了越来越多研究者的目光。国际上已有采用rcAAV表达单链抗体的先例，本课题首次尝试在杆状病毒生产系统中生产双链AAV，并包装表达全长抗体，为AAV—抗体的研究奠定基础。 本课题的主要工作是通过基因改造，使得带有dsITR序列的质粒携带抗体表达基因经过杆状病毒重组后，与另一个表达AAV外壳的重组杆状病毒共转染sf9细胞，重组产生能够表达抗体的双链AAV。具体工作内容及结果如下： （1）对pABVN-EF1a-EGFP质粒进行设计改造得到dspABVN-EF1a-EGFP质粒，并将上述两个质粒分别与DH10Bac感受态进行转座重组，并经PCR反应鉴定正确后经过对sf9细胞转染后获得重组杆状病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP。 （2）对已有的重组杆状病毒ABPM8进行蛋白印迹（Western blot）检测，结果表明ABPM8确已表达Cap蛋白，且三种蛋白的比例约为1:1:10。采用Real-time PCR进行滴度检测，结果表明获得的ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP三种重组杆状病毒滴度分别为3.1×10~(10)VG/ml、3.6×10~(10)VG/ml和3.025×10~(10)VG/ml。 （3）将表达外壳蛋白的ABPM8分别与杆状病毒ABVNM-EF1a-EGFP及dsABVNM-EF1a-EGFP在sf9细胞中进行重组，成功生产出ssrAAV8-EGFP和scrAAV8-EGFP，收集纯化后采用感染HEK293细胞来检测病毒活性并对两种AAV进行比较，通过表达出的荧光可见scrAAV8-EGFP具有明显的优势。 （4）在上述基础上本课题构建完成了dspABVN-EF1a-AT7载体，转座重组并经PCR鉴定正确后转染sf9细胞，获得的dsABVNM-EF1a-AT7杆状病毒滴度为3.1×109VG/ml，并与ABPM8重组后生产出scrAAV8-AT7，纯化感染HEK293细胞后收集上清，蛋白印迹法检测出阿瓦斯汀（Avastin）重轻链的成功表达，ELISA检测出Avastin的表达量可达770ng/ml。 上述结果表明本课题已初步探索出可以利用杆状病毒系统来生产表达Avastin的双链AAV，且生产出的病毒具有生物学活性并能实现外源基因的体外表达。
【关键词】：杆状病毒 双链AAV Avastin 病毒生产
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 缩略词表14-15
• 第一章 肿瘤治疗的研究进展15-25
• 1.1 前言15-23
• 1.1.1 抗体治疗肿瘤相关15-16
• 1.1.2 Avastin16
• 1.1.3 杆状病毒表达载体系统（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）16-17
• 1.1.4 AAV 简介17-23
• 1.2 实验设计方案及课题内容23-25
• 1.2.1 本课题的研究目的和意义23-24
• 1.2.2 本课题的研究内容24-25
• 第二章 单双链带有 EGFP 重组杆状病毒的生产25-48
• 2.1 实验器材25-28
• 2.1.1 实验材料25
• 2.1.2 实验仪器25-26
• 2.1.3 实验试剂26-28
• 2.2 实验方法28-38
• 2.2.1 pABVN-EF1a-EGFP 菌株的鉴定28-30
• 2.2.2 dspABVN-EF1a-EGFP 菌株的构建及鉴定30-31
• 2.2.3 单双链带有 EGFP 的 Bacmid 的获得31-33
• 2.2.4 单双链带有 EGFP 的重组杆状病毒的包装及检测33-36
• 2.2.5 重组杆状病毒 ABPM8、ABVNM-EF1a-EGFP 和 dsABVNM-EF1a-EGFP 的滴度测定36-38
• 2.3 实验结果38-46
• 2.3.1 pABVN-EF1a-EGFP 的酶切鉴定结果38-40
• 2.3.2 dspABVN-EF1a-EGFP 的鉴定结果40-42
• 2.3.3 ITR 部分的 PCR 检测结果42
• 2.3.4 转座重组的鉴定结果42-43
• 2.3.5 重组杆状病毒转染及扩增结果43-44
• 2.3.6 重组杆状病毒滴度结果44-46
• 2.4 讨论46-47
• 2.5 小结47-48
• 第三章 rAAV8-EGFP 的生产、纯化、鉴定48-57
• 3.1 实验器材48-50
• 3.1.1 实验材料48
• 3.1.2 实验仪器48
• 3.1.3 实验试剂48-50
• 3.2 试验方法50-54
• 3.2.1 cap 基因表达的 Western Blot 检测50-52
• 3.2.2 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的生产52
• 3.2.3 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒的纯化52-53
• 3.2.4 ssrAAV8-EGFP/scrAAV8-EGFP 病毒活力的检测53-54
• 3.3 实验结果54-56
• 3.3.1 重组杆状病毒 ABPM8 cap 基因表达的 Western blot 检测54
• 3.3.2 rAAV8-EGFP 的荧光表达54-55
• 3.3.3 rAAV8-EGFP 的活力检测55-56
• 3.4 讨论56
• 3.5 小结56-57
• 第四章 dspABVNM-EF1a-AT7 载体的构建及 scrAAV8 的包装鉴定57-77
• 4.1 实验器材57-58
• 4.1.1 材料与试剂57
• 4.1.2 仪器与设备57
• 4.1.3 试剂的配制57-58
• 4.2 试验方法58-66
• 4.2.1 dspABVNM-EF1a-AT7 的载体构建58-62
• 4.2.2 dspABVNM-EF1a-AT7 重组杆状病毒的生产、检测62-64
• 4.2.3 scrAAV8-AT7 病毒的生产纯化64-65
• 4.2.4 纯化后 dsrAAV8-AT7 病毒滴度的检测65
• 4.2.5 dsrAAV8-AT7 病毒活力的检测65-66
• 4.3 实验结果66-75
• 4.3.1 dspABVN-EF1a-AT7 质粒的构建66-71
• 4.3.2 转座重组的鉴定71
• 4.3.3 重组杆状病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的鉴定71-72
• 4.3.4 重组杆状病毒 dsABVNM-EF1a-AT7 的滴度检测72-73
• 4.3.5 纯化的 scrAAV8-AT7 的滴度检测73-75
• 4.3.6 Avastin 表达的 Western Blot 检测75
• 4.3.7 Avastin 表达量的 ELISA 检测75
• 4.4 讨论75-76
• 4.5 小结76-77
• 结论77-79
• 参考文献79-84
• 致谢84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈颖伟;久保寺;李一;大西威一郎;仁科一隆;李定国;横田隆德;;8型腺相关病毒介导短发夹状RNA在小鼠肝脏的表达及其功能[J];上海交通大学学报(医学版);2007年12期

本文编号：987347