分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及其对自噬功能的影响

发布时间：2017-10-07 18:22

  本文关键词：分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及其对自噬功能的影响

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【摘要】：目的： 1.建立分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型，探讨分枝菌酸包被聚苯乙烯微球诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞化的条件及特性。 2.建立稳定表达pEGFP-LC3B的RAW264.7细胞模型。 3.探讨分枝菌酸所致巨噬细胞泡沫细胞化对细胞自噬功能的影响。 方法： 1.将RAW264.7细胞分为空白对照组和分别包被0、25、50、75、100μg/mL分枝菌酸的聚苯乙烯微球实验组，分别将细胞与聚苯乙烯微球混匀，共同孵育24、48、72h、5d和8d后，油红O染色，显微镜下观察细胞形态，采用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定各组泡沫细胞内胆固醇酯的含量，采用MTT法检测细胞增殖水平。 2.以RT-PCR法扩增小鼠LC3B基因，双酶切后插入真核表达载体pEGFP-C1中，构建pEGFP-LC3B重组质粒。 3.经双酶切及测序鉴定后，将pEGFP-LC3B重组质粒用脂质体2000转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，经G418压力筛选出稳定转染克隆并将其扩大培养，在荧光显微镜下观察转染结果。 4.将细胞分为三组，分别为空白RAW264.7细胞组、pEGFP-LC3B/RAW264.7细胞组以及用75μg/mL MA诱导5d的pEGFP-LC3B/RAW264.7细胞组。RT-PCR法检测各组细胞中Becn1及LC3B mRNA转录水平，Western-blot法检测各组细胞中蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比值变化。 结果： 1.当包被分枝菌酸浓度为75μg/mL、吞噬时间为24h时，RAW264.7能形成典型的泡沫细胞，其细胞内胆固醇酯相对含量为60.98%±1.32%；随着吞噬时间延长，形成泡沫细胞所需的分枝菌酸的浓度逐渐递减；且随着细胞泡沫化程度增加，细胞增殖活力逐渐减弱。 2.经双酶切及测序鉴定，pEGFP-LC3B重组质粒构建成功。 3.将pEGFP-LC3B重组质粒转染RAW264.7细胞，经G418加压筛选后获得了表达绿色荧光蛋白的稳定转染株。 4.与对照组相比，RAW264.7细胞诱导成为泡沫细胞后其Becn1基因转录水平和LC3B表达水平降低，蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值降低，差异均具有统计学意义(P0.05)。 结论： 1.成功构建分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型。分枝菌酸包被聚苯乙烯微球可快速诱导巨噬细胞形成泡沫细胞，分枝菌酸浓度与细胞泡沫化程度呈正相关，且呈时间依赖性。 2.成功构建pEGFP-LC3B/RAW264.7细胞模型，，为后续实验中动态观察细胞自噬过程及对自噬功能的研究奠定基础。3.当巨噬细胞被MA诱导成为泡沫巨噬细胞后其自噬水平降低。
【关键词】：分枝菌酸 巨噬细胞 泡沫细胞 微管相关蛋白1轻链3B 自噬
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 第一部分 分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定15-24
• 1 材料和方法15-18
• 2 结果与分析18-22
• 3 结论22-24
• 第二部分 重组质粒 pEGFP-LC3B 的构建及其稳定转染细胞株的建立及鉴定24-36
• 1 材料和方法24-32
• 2 结果与分析32-35
• 3 结论35-36
• 第三部分 分枝菌酸所致泡沫细胞化对巨噬细胞自噬功能的影响36-45
• 1 材料与方法36-42
• 2 结果与分析42-44
• 3 结论44-45
• 讨论45-48
• 参考文献48-50
• 全文总结50-51
• 本研究的创新点50
• 本研究的不足之处50-51
• 文献综述51-60
• 参考文献58-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间发表的文章61-62

【参考文献】

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1 韩中博;张鹏;付强;李小兰;葛军娜;陶德定;胡俊波;龚建平;;肿瘤细胞自噬的诱导及其细胞周期分析[J];癌症;2006年09期

本文编号：989377