毛囊干细胞和异种脱细胞支架复合培养方法及组织相容性研究

发布时间：2018-03-24 07:41

本文选题：毛囊干细胞　切入点：异种脱细胞支架　出处：《新疆医科大学》2014年博士论文

【摘要】：目的：1.建立毛囊干细胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)的体外培养方法并使用目前公认的标记物和其他手段对其进行鉴定。2.应用不同培养基，检测细胞的增值情况，找出毛囊干细胞最适宜的培养条件。3.构建兔膀胱脱细胞基质(Bladder acellularmatrix, BAM)支架，将培养的毛囊干细胞种植于BAM构建细胞与支架的复合物，并在体外观察该复合物的生物学相容性。方法：1.选用出生7-9天的清洁级SD大鼠乳鼠。经过严格消毒拟切除触须部位后，切取含毛囊的组织，在无菌环境下使用显微外科技术分离出毛囊组织和毛囊外根鞘部。用中性蛋白酶和胰酶消化毛囊外根鞘部；利用差速贴壁法筛选贴壁快的细胞后用10%胎牛血清角质细胞培养基培养。培养的细胞可供进一步传代或冷冻处理。培养出来的细胞应用倒置显微镜、电子显微镜、Giemsa染色、免疫荧光染色、流式细胞仪等鉴定，将β1整合素、 CK15、 CD34，CK7等细胞表面标志物作为鉴定依据。2.进一步用富血小板血浆对第三代毛囊干细胞进行细胞增殖实验，以便获取更多的优质毛囊干细胞备用；将培养的干细胞悬液平分为三组，分别用DMEM/F12培养+体积分数10%胎牛血清、角质细胞无血清培养基和角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清培养，对三组培养后的干细胞应用细胞活率、生长曲线、流式细胞仪鉴定标记物对三种培养基的培养效率进行比较。3.选用兔龄3-5月的新西兰兔，空气栓塞法处死，手术切取膀胱后显微手术获取粘膜下层，化学洗涤法制备膀胱脱细胞基质，其表面的结构和形态特征使用扫描电镜观察，扫描电竞还可以同时判断脱细胞处理后细胞的残留与否以及脱细胞处理的效果；用Masson染色对支架材料再次鉴定；参照GB/T16886.5-2003体外细胞毒性和国家医疗器械生物学评价标准判断其细胞毒性。最后使用毛囊干细胞生长悬液，将细胞种植到支架上，通过绘制生长曲线、扫描电镜观察和组织学检查明确其生物相容性。结果：1.倒置相差显微镜观察筛选后的细胞，呈现的形态均匀一致、折光性强、呈典型的“铺路石状”。透射电镜观察发现细胞特征为核浆比例大、细胞器发育不成熟、体积小，可以认定为处于原始状态。生长曲线显示： P3一P6代细胞增值能力仍较强。第三代HFSCs细胞，流式细胞仪检测干细胞标记物CK15、CD34，CK7，β1整合素等四个指标记物，其中标记物CD34与β1整合素，CK15实验组均高于对照组，两组间差异有统计学意义（p0.05），而CK7在对照组与实验组均低表达，差异无统计学意义(P0.05)。2.用CCK-8比色法检测二次离心法获得的血小板（A组）及三次离心法获得的血小板（B组）对细胞增殖的影响即：各组细胞的吸光度A值，进行统计分析后显示在培养前的2天各组之间及其和对照组之间的吸光度A值差异无显著性意义(P0.05)。第4天时A、B各富血小板血浆与对照组之间比较均有显著统计学差异(P 0.05），第4、5、6天时，，应用三次离心法和应用两次离心法制备的富血小板血浆（包括2%浓度的富血小板血浆和4%浓度富血小板血浆组）进行比较后有统计学意义（P0.05）。说明三次离心法制备的富血小板血浆对毛囊干细胞增殖作用效果更为的明显。并且，也证明了在其他培养条件相同的情况下，高剂量富血小板血浆与低剂量富血小板血浆组比较，高剂量对促进毛囊干细胞增殖的作用更加明显，实验结果也显示三次离心法制备的浓度4%组的毛囊干细胞增殖作用最为明显。准备K-SFM+10%FBS，K-SFM，DMEN/F12+10%FBS等三种培养条件进行培养。第三代的HFSCs培养到第6天，统计学方法计算细胞活率后可见DMEN+10%FBS组为（96.62±2.00）%，K-SFM+10%FBS组为（95.26±2.27）%，K-SFM组为（93.95±2.54）%，而三组细胞之间相互比较可见，细胞存活率方面三组比较差异均无统计学意义（P0.05）。三组细胞前2d生长均较为缓慢，DMEN+10%FBS以及K-SFM+10%FBS细胞培养4d进入了对数生长期；而K-SFM组于5d才进入了对数生长期，K-SFM+10%FBS组7d进入平台期，K-SFM组及DMEN+10%FBS组8d后才进入平台期。培养到第三代的HFSCs第6d，取三组细胞，分别测定β1整合素（CD29）、CK15、 CD34三个细胞表面标记。所测的结果经过比较可见： K-SFM与K-SFM+10%FBS组较DMEN+10%FBS组CD34、CK15、β1整合素（CD29）表达高，差异有统计学意义（P0.05），而K-SFM组与K-SFM+10%FBS组比较仅CD34表达较组高（P0.05），β1整合素（CD29）和CK15两个细胞表面标记物K-SFM+10%FBS和K-SFM比较差异无统计学意义（P0.05）。3.扫描电子显微镜下观察，制备的BAM为纤维网状结构，网状结构之中能见不规则的空隙，BAM表面未见残留细胞。Masson染色结果显示，膀胱各层解剖结构清晰，仅能见到均质状态的蓝色薄层胶原纤维，并且没有看见残留的细胞。不同浓度的BAM浸提液对细胞的毒性分级为0级或1级。将细胞支架复合物置于倒置显微镜下观察，粘附于支架材料表面的细胞梭形生长，细胞排列方向一致，皿底细胞贴壁，增殖情况良好，呈“铺路石状”生长。复合培养第5天，材料周围的皿底细胞汇合达到80%以上，材料表面的细胞数量也明显的增加。细胞-支架复合培养之中，对照组与实验组细胞经过测定，生长曲线增殖一致，均于培养到7-8天进入平台期。进一步表明，细胞于材料的表面生长状况良好，毛囊干细胞和BAM材料具有良好的生物相容性。结论：1.通过联合应用显微分离技术、两步酶法以及差速贴壁法，能够获得纯度较高，增殖能力强的毛囊干细胞。联合使用CD34、β1整合素，CK15等细胞标记物可以进行毛囊干细胞的鉴定。毛囊干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞分化能力，可作为组织工程中的种子细胞。2.富血小板血浆对毛囊干细胞的增长有促进作用，三次离心法浓度为4%组富血小板血浆对细胞增殖效果最明显。K-SFM+10%FBS培养基较DMEM/F12培养基对于毛囊干细胞的生长有更好的促进作用，并且加入血清后可以增强干细胞增殖能力，而对细胞纯度基本没有影响。3.膀胱脱细胞支架的细胞毒性很低，与培养的大鼠HFSCs的生物相容性良好，可作为构建膀胱的生物支架材料。体外培养7-8天后细胞在皿表面以及脱细胞支架上的生长进入了平台期，此时是将毛囊干细胞-膀胱脱细胞基质支架复合物移植到大鼠体内的最佳时机。本研究对毛囊干细胞体外培养、构建BAM、以及细胞-BAM复合物进行了探索，为我们将HFSCs-BAM复合物植入体内以及将组织工程膀胱应用于临床，提供了重要的实验依据。
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【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318

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