高分子多糖——壳聚糖的定性、定量分析方法的探究

发布时间：2020-03-31 05:05

【摘要】：研究目的壳聚糖(chitosan)是一种来源广泛的高分子碱性多糖,具有低毒性、可降解性和良好的生物学活性,在农业、食品、医用敷料和载药系统等领域有着广泛的应用。尽管壳聚糖具有低毒性的特点,在应用过程中仍有必要建立一种可以对壳聚糖进行定量检测的方法,该方法的建立对壳聚糖医用敷料和载药系统中的含量测定及质量控制也具有重要意义。质谱(MS)是一种应用广泛的定性、定量分析技术,检测的是化合物的特异性的质荷比(m/z)。壳聚糖是由随机分布的脱乙酰化单体(N-glucosamine,GlcN)和乙酰化单体(N-acetyl-glucosamine,GlcNAc)组成的分子量大且不均一的共聚物,因此,利用质谱技术对壳聚糖进行检测存在很多挑战。目前,国内外文献报道中,利用质谱技术对分子量低于2 kDa的壳寡糖(Chito-oligosaccharide,COS)进行分析的报道较多,暂无利用质谱技术对壳聚糖进行定性、定量分析的报道。壳聚糖分子中仅含有GlcNAc和GlcN两种单体,其在质谱仪的离子源中可能会发生源内裂解或形成带多电荷的离子,这些带电离子形成的规律可能与壳聚糖的分子量、脱乙酰度和浓度存在相关性,本研究旨在探究壳聚糖在ESI源中形成的质谱图的规律,并根据这一规律,尝试建立一种能够对壳聚糖进行定性、定量分析的质谱方法,为壳聚糖及其相关材料的应用研究提供一种灵敏度高、特异性好、分析速度快的技术手段。第一章壳聚糖的纯化及分子量的测定本研究中通过分子排阻色谱串联示差检测器(SEC-RID)法对9种商品化壳聚糖的分子量进行了测定。在商品化壳聚糖的生产过程中可能会有壳寡糖生成,本研究中对粘度范围(50~800 mPa·s)最大的壳聚糖样品(chitosan 7)进行了纯化,并对纯化前、后壳聚糖分子量的差异和是否含有壳寡糖进行了比较。纯化方法分为两步:(1)在酸性溶液中对壳聚糖进行溶解并过滤,该过程可以除去分子量过大或脱乙酰度过低的壳聚糖,(2)在碱性溶液中对壳聚糖进行再沉淀,该过程可以除去小分量的壳聚糖。通过SEC-RID法测得9种壳聚糖的重均分子量在106.1~485.1 kDa范围内。在纯化前、后Chitosan 7样品中均未检测到壳寡糖,重均分子量分别为485.1 kDa和367.7 kDa,经纯化后壳聚糖的分子量减小约24.20%。SEC法的灵敏度较低,可能无法检测到壳聚糖样品中含量较低的壳寡糖,因此需要建立一种灵敏较高的方法对壳寡糖进行检测。第二章壳聚糖脱乙酰度的测定有关壳聚糖脱乙酰度测定方法的研究有很多,最常用的方法为酸碱滴定法和核磁共振氢谱法,本研究中采用这两种方法对9种购自不同厂家的壳聚糖样品的脱乙酰度进行了测定,并对这两种方法测定的结果进行了比较。酸碱滴定法测得9种壳聚糖的脱乙酰度在63.80~86.19%范围内,核磁共振氢谱法测得结果略高,在69.97~89.06%范围内,两种方法测定结果的偏差在-8.82~-0.80%范围内。文献报道中普遍认为核磁共振氢谱法测得的结果较为准确,该方法适用能溶解于酸性溶液的壳聚糖样品的检测,检测结果的准确性不受样品称量准确性的影响,测试前后样品溶液pH无变化,不会有壳聚糖沉淀析出,但是所需要的仪器及仪器操作方法较复杂。酸碱滴定法测得的结果比核磁共振氢谱法测得的结果低,但是两种方法测得结果偏差较小,因此酸碱滴定法可用于壳聚糖的定性分析。酸碱滴定法所需仪器设备简单,操作方便,需要对壳聚糖样品进行准确称量并准确判断滴定终点。第三章UPLC-MS/MS法测定壳聚糖样品中的壳寡糖壳寡糖(Chito-oligosaccharide,COS)通常是通过对壳聚糖进行降解制备得到的,也具有良好的生物学特性。壳聚糖和壳寡糖都是由GlcNAc单体和GlcN单体组成的聚合度不同的物质,两者的化学结构相似,在质谱仪内形成的带电离子可能会互相干扰测定。因此,本研究中建立了灵敏度较高的UPLC-MS/MS方法对壳聚糖和壳寡糖进行分离、检测。聚合度(DP)为1~7的壳寡糖标准品的洗脱分别通过XBRIDGE BEH 130 C18色谱柱和BEH Amide色谱柱进行评价。XBRIDGE BEH 130 C18色谱柱是一种反相色谱柱,壳寡糖(DP 1~7)在该色谱柱上的保留时间分别为0.48、0.45、0.43、0.41、0.40、0.39和0.38 min,壳聚糖的保留时间为0.30 min。虽然该方法未能完全分离壳寡糖和壳聚糖,但是可用于这两种样品的定性分析。在壳聚糖样品中检测到壳寡糖的离子对,但是保留时间为0.30 min,说明:(1)壳聚糖样品中的壳寡糖含量低于检出下限;(2)壳聚糖在质谱的ESI源内发生了源内裂解,生成了壳寡糖的离子对。BEH Amide色谱柱是一种亲水作用色谱柱,适用于多肽和多糖的分析。壳寡糖(DP 1~5)在该色谱柱上的保留时间分别为2.98、3.32、3.58、3.79和4.10 min。该方法可完全分离聚合度为1~5的壳寡糖,但是未能洗脱、检测到聚合度大于5的壳寡糖。在壳聚糖样品中未检测到聚合度为1~5的壳寡糖。由于壳聚糖的聚合度大于5,该方法也未能洗脱壳聚糖,因此未检测到壳聚糖发生源内裂解后生成的壳寡糖离子对。但是,在高聚合度的壳寡糖标准品中检测到的低聚合度的壳寡糖的离子对,说明壳寡糖在质谱ESI源内也易发生源内裂解。第四章壳寡糖和壳聚糖在ESI源中形成的质谱图的规律解析在第三章研究中发现了壳聚糖和壳寡糖在ESI源内都易裂解,本研究通过Synapt G2-Si Q-TOF高分辨质谱系统对壳寡糖和壳聚糖在100~1200 m/z范围内的质谱图进行检测,并对两者在ESI源内形成带电离子的规律进行解析。通过对得到的质谱图进行分析发现:壳寡糖和壳聚糖在ESI源易发生源内裂解,且裂解规律相似;9种不同来源的壳聚糖样品,在ESI源内裂解后,检测到了相同的质谱图,质谱图中的离子主要是由壳聚糖的脱乙酰化单体(GlcN,161.07 Da)和乙酰化单体(GlcNAc,203.08 Da)组成的,部分离子会发生源内脱水,说明壳聚糖在ESI源内的裂解主要是由糖苷键的断裂和脱水造成的。随着质荷比的增加,离子的响应值下降,当质荷比大于1200 m/z时,检测到的离子的响应值均较低,说明大部分壳聚糖分子在ESI源内发生了裂解,丰度最高的带电离子主要由不同聚合度的GlcN单体构成。其中毛细管电压是影响源内裂解最主要的因素,当毛细管电压为2.4 kV时各个离子的响应值最高。第五章壳聚糖的质谱特征与脱乙酰度的相关性研究壳聚糖在ESI源内易发生源内裂解,生成的由GlcN单体组成的特征离子的相对丰度最高,本实验中主要对这些离子进行检测。为避免这些带电离子在碰撞室内进一步裂解生成相同的带电离子,而相互干扰测定,本实验中建立了一种假二级的检测方法(UPLC-pseudo-MS/MS法),在碰撞室中未提供碰撞能量,检测的离子对为323.17→323.17(2 GlcN),484.22→484.22(3 GlcN),645.28→645.28(4 GlcN),806.33→806.33(5 GlcN)和967.20→967.20(6 GlcN)m/z,并对这些离子对的响应值与壳聚糖脱乙酰度之间的相关性进行了研究。通过对五个离子对的响应值进行统计分析,发现虽然9种壳聚糖样品的脱乙酰度和分子量各不相同,但是在9种壳聚糖样品中五个离子对相对丰度都接近100.00:63.12:43.85:27.04:11.82,说明壳聚糖在ESI源内裂解生成不同质荷比的带电离子的比例是相近的。带电离子323.17(2 GlcN),484.22(3 GlcN),645.28(4GlcN),806.33(5 GlcN)和967.20(6 GlcN)m/z的响应值与~1H NMR法和酸碱滴定法测得脱乙酰度间的相关系数R分别为0.9578,0.9612,0.9795,0.9891,0.9765和0.9878,0.9722,0.9807,0.9786,0.9648,脱乙酰化单体组成的离子的响应值与壳聚糖的脱乙酰度之间呈现良好的线性关系,该研究提供了一种新型的壳聚糖脱乙酰度测定的方法,该方法灵敏度高,分析时间短,适用于可溶性壳聚糖的脱乙酰度的测定,但是该方法需要利用已知脱乙酰度的壳聚糖标准品来绘制标准曲线,同时还需要对壳聚糖样品进行准确称量。第六章壳聚糖定量分析方法建立的初步探究在第五章研究中,发现壳聚糖经源内裂解后生成的各个离子比例是相近的,对于同一壳聚糖样品来说,这些离子的响应值可能与壳聚糖的浓度存在相关性。本研究中通过建立的UPLC-psedo-MS/MS法对响应值较高且受到干扰较小的484.22→484.22 m/z离子进行了检测,并考察该离子的响应值与壳聚糖浓度间的相关性。并利用建立的质谱方法对壳聚糖复合止血贴和商品化壳聚糖止血粉中的壳聚糖含量进行了测定;然后尝试对加入生物基质的壳聚糖样品进行提取、检测。经验证,在纯溶剂中,壳聚糖在0.1~10μg/mL浓度范围内与检测离子的响应值间呈现较好的线性关系。两种壳聚糖止血敷料通过1%乙酸溶液溶解、提取后,利用建立的方法进行检测,测得壳聚糖复合止血贴中壳聚糖的含量为19%;测得壳聚糖止血粉中壳聚糖的含量为120%,比实际值高20%。在该研究中发现:壳聚糖复合材料中壳聚糖的提取方法和壳聚糖标准品与待测样品的脱乙酰度的差异是影响测定结果准确性的两个重要因素。壳聚糖是一种分子量高、极性大的化合物,生物样品中的壳聚糖的提取方法的建立存在很多挑战,本研究中初步探究了利用沉淀蛋白法提取生物基质中的壳聚糖的可行性,但是提取回收率较低。生物样品中的壳聚糖的提取方法需要进一步的优化。结论本研究首先通过传统方法对壳聚糖的脱乙酰度和分子量进行了测定。然后建立了可用于分离、检测壳寡糖和壳聚糖的UPLC-MS/MS方法,该方法灵敏度高、特异性好,可用于9种壳聚糖样品中的壳寡糖的检测分析。在壳寡糖和壳聚糖的质谱图的分析研究中,首次阐明了壳聚糖在ESI源内形成带电离子的规律:壳聚糖分子在ESI源内的裂解主要有糖苷键的断裂和脱水,生成的带电离子的质荷比可通过公式m/z=m·D+n·A+0/1·H_20+H~+(m,n∈N,D=161.07 Da,A=203.08 Da)计算,绝大多数带电离子的质荷比小于1200 m/z,说明壳聚糖的源内裂解过程较彻底。通过UPLC-pseudo-MS/MS方法对壳聚糖源内裂解生成的离子进行测定,发现壳聚糖源内裂解生成的由GlcN单体组成的离子的响应值与壳聚糖的脱乙酰度间呈现良好的线性关系。利用已知脱乙酰度的壳聚糖样品拟合标准曲线后,可对未知壳聚糖样品的脱乙酰度进行测定,该方法是一种新型的壳聚糖脱乙酰度测定方法,与传统方法相比较具有分析时间短、灵敏度高的特点。壳聚糖源内裂解产生的特征离子的响应值与壳聚糖的浓度之间也呈现良好的线性关系,本研究中利用这一规律建立了UPLC-pseudo-MS/MS方法,该方法可用于壳聚糖及其制备的材料的定性和定量分析。
【图文】：

甲壳素,壳聚糖,结构式,脱乙酰化

前言甲壳素（结构式如图 1 所示）是地球上最丰富的自然资源之一，广泛分布于植物、海洋无脊柱生物、昆虫的外骨骼、真菌的细胞壁和一些微生物中[1, 2]。甲壳素是一种线性高分子聚合物，主要由脱乙酰化单体（N-glucosamine, GlcN）和乙酰化单体（N-acetyl-glucosamine, GlcNAc）通过糖苷键随机组合而成，它难溶于水及常见的有机试剂，，有文献报道一些特殊的溶剂，如(DMAc)-LiCl（二甲基乙酰胺-氯化锂），可用作甲壳素的溶剂[3]。在高温、强碱性条件下可使甲壳素中的乙酰化单体发生脱乙酰化反应，制备得到壳聚糖[4-6]。壳聚糖也是一种线性高分子聚合物，它与甲壳素的主要区别在于分子中的脱乙酰化单体的百分含量（即脱乙酰度，Degree of Deacetylation, DD）不同，一般将脱乙酰度大于 50%的甲壳素称为壳聚糖。由于壳聚糖分子中 50%以上的单体含有氨基，是一种碱性多糖，易溶解于 pH 低于6.0 的酸性溶液中，呈现阳离子特性[7, 8]。通过提取生物来源的甲壳素，经脱乙酰化反应和纯化后制备得到的壳聚糖通常由一系列聚合度接近的大分子组成，脱乙酰化单体和乙酰化单体随机分布于这些分子中，结构式如图 1 所示。

色谱图,葡聚糖,右旋,色谱图

右旋葡聚糖 6 kDa（A）、670 kDa（B）、Chitosan 7 纯化前（C）、后（D）和空白溶（E）的 SEC 色谱图 SEC chromatograms of dextran (6 kDa (A), 670 kDa (B)), Chitosan 7 (C), purified Chito7 (D) and solvent (E).4.2 壳聚糖样品及纯化后壳聚糖分子量测定种不同分子量的右旋葡聚糖标准品在 SEC 系统中的保留时间如表 1.2 中 kDa 和 670 kDa 右旋葡聚糖的色谱图如图 1.1（A& B）所示。在分子排阻化合物的分子量的对数与保留时间呈负相关，利用 LC solution 工作站的旋葡聚糖的保留时间和其分子量拟合标准曲线，相关系数 R 为 0.9977，的标准曲线计算 5 种右旋葡聚糖标准品的分子量（如表 1.2 所示），与理差在-13.57 ~ 17.93%范围内。表 1.2 五种分子量的右旋葡聚糖在 SEC 中保留时间和重均分子量计算值Table 1.2 RT and calculated Mw of 5 kinds of dextranRT (min) Mw 计算值(Da) Mw 理论值(Da) RE (%)7.23 618537 670000 -7.68
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08

【参考文献】