诱导多能干细胞源性间充质干细胞联合微孔化脱细胞真皮基质构建人工复合皮的初步研究

发布时间：2020-04-08 09:12

【摘要】：目的:利用慢病毒转染人成纤维细胞来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells iPSCs)分化得到的间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)作为种子细胞在体外联合微孔化脱细胞真皮基质(micropore acellular dermal matrix MADM)构建人工复合皮,移植于SD大鼠全层损伤皮肤模型创面,观察和分析此种复合皮的创面修复能力,以验证新型种子细胞iPSCs源性MSC在创面修复过程中的效果。方法:1、复苏人成纤维细胞来源的iPSC-MSCs,传代培养记录细胞生长曲线,并通过成脂诱导分化和成骨诱导分化实验简单验证细胞的多能性。分离大鼠背部皮肤经酶消化法联合去污剂法制备ADM,激光打孔后获得MADM。将种子细胞MSCs接种于ADM制备人工复合皮,通过DAPI染液染色标记细胞,镜下计数并观察细胞生长情况,酶标仪检测450mm波长处OD值判断ADM的细胞毒性。2、取12只SD大鼠实验前喂养数天,常规腹腔麻醉,于背部正中部位做U形皮瓣切口,皮瓣边长2厘米,完整去除全层皮肤,分离皮下筋膜,灼热铁丝止血并烫伤创周表皮。将12只SD大鼠随机分成2组:A组MSCs+MADM复合皮组、B组单纯MADM组。将MSCs+MADM复合皮、单纯MADM分别移植于对应组创面上,凡士林油纱覆盖,打包法缝合固定后分笼饲养。分别于植入后第1周、第2周、第3周和第4周肉眼观察创面外观及移植皮片周缘的组织生长状况,并经过组织学HE染色鉴定镜下组织生长。荧光显微镜下观察实验组复合皮细胞的存活情况。记录各组各只大鼠创面完全恢复时间,进行统计学分析。结果:1、实验动物数量分析:实验纳入SD大鼠12只,分为2组,进行结果分析的大鼠12只,实验中无脱失。2、iPSC-MSCs的体外培养及传代:复苏第8代细胞接种后呈圆形,24小时后大部分细胞贴壁,贴壁生长细胞逐渐呈现梭型及类圆形,6-8天后细胞多呈长梭型,成纤维细胞样、漩涡状生长。培养周期为10-12天。成脂分化诱导并经油红O染色后可见大而圆的脂滴,成骨诱导分化并经茜素红染色可见钙沉淀。表明iPSC-MSC与其他类型MSCs具有十分相似的生长特点,细胞活性和多能性良好,分化潜能巨大。酶标仪OD值检测显示联合培养细胞与单纯培养细胞差异不明显,说明制备的MADM性能良好,无细胞毒性,可用于复合皮制备及动物实验。3、创面大体观察:A组人工复合皮移植组平均愈合时间为17.33天,镜下见人工复合皮周围大量新生网状血管包绕,颜色红润,触之质地较柔软,与皮下组织融合紧密,边界模糊。B组单纯MADM移植组创面平均愈合时间为21.83天,移植皮片周围新生血管较多,但明显少于实验组A组,且皮片与皮下组织融合状况一般,边界较清楚。统计学分析两组愈合时间,差异有显著性意义(P0.05)。表明新型种子细胞制备的人工复合皮能够更好地促进创面修复。4、组织学HE染色检查及荧光显微镜下观察:移植初期,实验组A组与对照组B组移植皮片周围均出现轻度炎症反应表现,HE染色示炎性细胞浸润,两组相差不大。移植后第2周观察显示:实验组A组血管网状结构明显多于对照组B组,A组皮下有乳头状结构突入复合皮内,与复合皮融合交错,且出现少许脂肪样组织;对照组B组周围也存在少许环形新生血管结构,皮片与皮下组织分界明显。荧光显微镜下可见移植第一周镜下蓝色荧光点较多,随着时间推移荧光逐渐暗淡,荧光点减少至消失,考虑细胞正常的代谢凋亡所致。结论:新型种子细胞iPSC-MSCs培养条件与常见MSCs相似,具有较高的分化潜能。人工制备MADM细胞毒性不明显,是较好的复合皮支架材料的选择。利用新型种子细胞iPSC-MSCs细胞联合MADM制备人工复合皮能够较好的加快创面修复进程,增加缺损组织填充,有希望成为一种广泛应用的种子细胞。
【图文】：

MADMHE染色×100附

诱导多能干细胞源性间充质干细胞联合微孔化脱细胞真皮基质构建人工复合皮的初步研究

MADMHE染色×200
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.1

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