软骨微组织体外培养及软骨微组织—仿生基质复合体体内体外培养的实验研究

发布时间：2020-04-28 15:42

【摘要】：研究意义及背景:自体肋软骨由于其组织量大,取材相对方便,在临床上常用作一种理想的修复、填充、支持材料。既往软骨移植方式常为采用大块的软骨组织或拼接后的软骨支架来进行器官的再造或修复以及受区欠缺的填充,这种方式存在着软骨用量多且灵活性差、浪费严重、修复效果不足、雕刻复杂、细节刻画不足等缺点。有人提出将软骨移植过程中所用的软骨团块的体积减小,以达到精细塑形的目的。关节外科领域有学者发现这种移植方式不仅可以增加其应用灵活性,而且可以提升软骨细胞增殖迁移活性,可部分达到类似于组织工程修复的效果,还可规避组织工程的缺点。我们设计了软骨微组织体外培养、构建肋软骨微组织-仿生基质复合体并体外培养,肋软骨微组织-仿生基质复合体塑形后即刻体内培养三部分实验予以探究。以明确肋软骨微组织-仿生基质复合体再生的具体过程及其机制,观察软骨微组织及上述复合体的生物学转归,以寻找一种可以提升移植软骨增殖活性,减少肋软骨采取量,提高自体肋软骨应用效率的方法,并提供实(试)验基础。研究目的:1.研究肋软骨微组织化后微组织体外培养细胞迁移及增殖情况,并探究软骨微组织的径长对软骨细胞迁移及增殖影响。2.构建软骨仿生基质,并形成软骨微组织-仿生基质复合体,在体外培养的过程中模拟软骨微组织体内移植后的局部环境,探究在这种条件下软骨微组织内软骨细胞的外迁及增殖活性。3.探究体内环境对软骨微组织-仿生基质复合体内细胞生物学特性的影响,探究复合体体内移植后的生物学转归。研究方法:1.采取小型猪肋软骨,用薄刃三孔刀片切割粉碎成软骨微组织,过实验细胞筛,获得径长分别为200um,200um～400um,400um～800um三组软骨微组织。体外培养14天,在第3天、7天、14天大体及显微镜下观察并比较各组软骨微组织内细胞迁出及增殖情况。2.提取Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ),并复合透明质酸(HA)及硫酸软骨素(CS),形成COLⅡ/HA/CS浓度为8/0.5/1.5mg/ml的仿生基质溶液,添加10×DMEM培养基形成含有DMEM培养基的仿生基质。将软骨微组织按与仿生基质溶液体积比1:1的比例混匀,孵育形成固体后体外培养14天,进行HE染色观察。3.采取小型猪肋软骨,形成软骨微组织,复合仿生基质形成固态软骨微组织-仿生基质复合体,在猪自体肋软骨采取术后4小时以内将上述复合体埋置入实验猪皮下。2月,4月后分两批取出所植入复合体,大体观察其生物学特性并做HE染色,观察其生物学转归。研究结果:1.肋软骨微组织化及软骨微组织径长对软骨细胞迁移及增殖影响的实验研究(1)薄刃刀片切割细胞筛过滤法形成的肋软骨微组织活性良好,部分软骨陷窝呈切开状态,陷窝内软骨细胞情况良好。(2)培养第 3 天、7 天、14 天,径长200um,200um～400um,400um～800um三组软骨微组织成活良好,软骨陷窝内软骨细胞成活良好。(3)培养第3天、7天、14天分别在40倍、100倍、200倍镜下观察径长200um,200um～400um,400um～800um三组软骨微组织,均未见细胞明显迁出及增殖。2.仿生基质的制备及其对软骨微组织软骨细胞迁移及增殖影响的实验研究(1)获得的固态仿生基质生物学特性良好,单纯仿生基质呈白色,加入DMEM培养基后形成的软骨微组织-仿生基质复合体呈淡粉色。仿生基质(复合体)具有类似鼻尖的硬度,弹性。(2)培养期观察软骨微组织-仿生基质复合体可见培养基清亮,肉眼观察复合体形态良好,形状及特性未见明显改变。排水法测量培养后软骨微组织-仿生基质复合体体积与培养前无明显差别。(3)镜下观察培养14天后的软骨微组织-仿生基质复合体HE切片示软骨微组织及软骨细胞在仿生基质中成活良好,软骨微组织外未见明显软骨细胞迁出,未见明显软骨细胞增殖。3.软骨微组织-仿生基质复合体自体即刻回植体内培养的实验研究(1)体内移植2月、4月后获取软骨微组织-仿生基质复合体,大体观察上述复合体形状不规则,在体内存在部分降解,随时间延长,其降解率提高。(2)大体观察移植后2月的软骨微组织-仿生基质复合体剖面可见局部存在不规则的软骨团块,质地及硬度较正常软骨稍差,各团块之间存在厚薄不均的纤维结缔组织。移植4月后复合体质地、硬度与正常软骨类似,其余同移植2月的复合体类似。(3)体内培养2月后的软骨微组织-仿生基质复合体HE切片示软骨微组织及软骨细胞存活良好,软骨仿生基质部分降解,未见明显的软骨细胞在软骨微组织外增殖。(4)体内培养4月后的软骨微组织-仿生基质复合体HE切片示软骨微组织及软骨细胞存活良好,软骨微组织间隙内存在大量纤维组织,间隙较内培养2月时明显缩短,仿生基质几乎不可见。100倍镜下观察,局部可见两种形式软骨微组织外增殖:1.以软骨微组织为中心的细胞簇样增殖,尚未见有大量的软骨基质分泌;2.软骨细胞散在增殖,伴基质分泌。研究结论:1.肋软骨微组织化及软骨微组织径长对软骨细胞迁移及增殖影响的实验研究(1)薄刃刀片切割细胞筛过滤法可切开软骨陷窝并形成活性良好的肋软骨微组织。(2)软骨微组织体外培养过程中微组织及其内的软骨细胞存活。(3)软骨微组织内的软骨细胞于培养14天内未见明显外迁及增殖。(4)软骨微组织的径长于组织内软骨细胞的迁移、增殖活性无明确关系。2.仿生基质的制备及其对软骨微组织软骨细胞迁移及增殖影响的实验研究(1)COL-Ⅱ/CS/HA所形成的肋软骨仿生基质生物相容性良好,组织及细胞在其内存活良好。(2)软骨微组织-仿生基质复合体体外培养14天体积无明显变化。(3)体外培养环境下,复合体内软骨细胞未见明确迁移与增殖;该仿生基质在体外培养环境下不能诱导软骨微组织内软骨细胞的迁移与增殖。3.软骨微组织=仿生基质复合体自体即刻回植体内培养的实验研究(1)软骨微组织-仿生基质复合体在体内有良好的生物相容性,仿生基质可被降解。(2)软骨微组织-仿生基质复合体内软骨组织成活良好,在体培养环境下纤维组织包裹成一整体。(3)皮肤下移植软骨微组织-仿生基质复合体的方式可以出现两种形式的细胞增殖:1.不伴基质分泌的以软骨微组织为中心的细胞簇样增殖;2.伴基质分泌的软骨细胞散在增殖。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

【参考文献】