掺铈硫酸钙新型骨替代材料的制备、生物安全性及其骨修复功能研究

发布时间：2020-05-10 11:52

【摘要】：研究背景创伤、感染、肿瘤及先天性疾病导致的骨缺损是临床治疗的难点。自体骨移植是治疗骨缺损的金标准,但是存在供区破坏、二次损伤、来源有限,且难以用于较大骨缺损的治疗。同种异体骨和重组异体骨存在疾病传播、排斥反应等不足。如何安全有效地治愈骨缺损是目前面临的巨大挑战,因此研究新型的骨替代材料修复骨缺损成为临床和基础研究的热点。研究目的研究医用可降解的新型骨替代材料掺铈硫酸钙的促成骨作用。硫酸钙具有良好的生物相容性和可降解性,其降解率与局部血管长入、新骨形成的速度一致,且具有可塑性,可以根据骨缺损的形状进行个体化制备。但是存在骨诱导活性不足、机械强度较差等缺点。而铈(Cerium,Ce)具有诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能,同时具有促进新生血管的生长,促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。本课题研究制备新型的掺铈硫酸钙骨替代材料,将铈作为一种骨诱导性因子与具有良好生物相容性和骨传导性的硫酸钙相结合,以增强骨替代材料的骨诱导活性,并在SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型中验证其促成骨作用,从而为骨缺损的治疗提供新的方法,并为其临床前应用提供科学依据。研究方法第一部分掺铈硫酸钙骨替代材料的制备及理化性能验证通过机械混合法制备梯度浓度的掺铈硫酸钙(Ce-CS)。X射线衍射实验(XRD)分析材料的结构组成;傅里叶红外扫描实验(FTIR)分析材料的晶体结构;扫描电镜(SEM)进行形貌观察;压力测试测定铈元素对材料机械强度的影响;第二部分新型掺铈骨替代材料的生物相容性制备不同浓度的掺Ce-CS浸提液;MTT法检测浸提液的细胞毒性;CCK-8法检测BMSCs的增殖情况;划痕实验检测BMSCs的迁移作用;荧光定量PCR检测掺Ce-CS对BMSCs促成骨分化基因的表达;Western-blot检测梯度的Ce-CS对BMSCs促成骨基因β-catenin、Smad2/3、BMP2/7和OPN的表达水平;第三部分掺铈硫酸钙材料的体内骨修复功能建立SD大鼠临界性胫骨缺损模型(48只,分4组,每组12只)植入不同掺铈浓度的支架(0%,5%,10%)。X线和micro-CT检测骨缺损的修复和新生骨的形成;HE染色和Goldner染色观察新骨质的生成及材料降解情况;免疫荧光法观察新生骨质周围血管的生成。主要结果1.XRD和FTIR显示Ce-CS的衍射光谱、红外光谱与硫酸钙类似;SEM显示掺铈材料表明圆钝粗糙;掺铈浓度为2.5%时机械强度最大23.45±1.35MPa,高于 CS 组的 21.25±1.31 MPa;2.梯度浓度掺铈硫酸钙培养L929细胞的增殖率差异没有统计学意义,不同掺铈浓度的硫酸钙提取液毒性反应均为Ⅰ级,无细胞毒性;5%Ce-CS促进BMSCs的增殖。划痕实验显示5%Ce-CS的划痕愈合率最大。用1.25%Ce-CS和5%Ce-CS浸提液培养时,BMSCs细胞内成骨标志物(ALP、OST、BSP、OCN)的表达量升高,转录因子RUNX2的表达量也比对照组高。3.X射线显示术后4周支架可以吸收。空白对照组骨缺损扩大,未观察到新骨形成,CS、5%Ce-CS和10%Ce-CS组填充物密度逐步降低,CS组只出现少量新生骨,5%Ce-CS和10%Ce-CS组有密度较低的新生骨填充。Micro-CT:5%Ce-CS和10%Ce-CS组骨缺损处有大量新生骨质,骨缺损接近愈合。HE染色、Goldner三色染色显示:空白对照组骨缺损明显,填充组织为纤维结缔组织。CS对照组骨缺损明显凹陷,有少量新骨生成。5%Ce-CS组移植物周围有大量新生骨质生成。免疫荧光法显示术后8周的5%Ce-CS和10%Ce-CS组骨缺损区可见大量血管内皮标志CD31+EMCN+形成。主要结论1.铈元素的加入对硫酸钙的晶体结构和化学组成无明显影响,随着铈浓度的升高,机械强度逐渐增加;2.铈元素浓度10%时,掺铈硫酸钙提取液细胞毒性为I级,无明显细胞毒性;3.掺Ce-CS能够促进BMSCs细胞增殖和迁移,5%铈浓度时作用最明显;4.掺Ce-CS促进了 BMSCs成骨标志物ALP、OCN等基因的表达和成骨调控因子Runx2的表达。5.胫骨骨缺损修复实验表明,5%和10%掺铈硫酸钙具有显著的促成骨作用;6.掺铈硫酸钙能够有效促进骨质周围新生血管的形成。
【图文】：

分装,称重,规格,复合材料

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｈａｐｅ，ｓｉｚｅ邋ａｎｄ邋ｗｅｉｇｈｉｎｇ邋ｓｕｂ－ｐａｃｋａｇｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ逡逑ｍａｔｅｒｉａｌｓ邋（Ａ邋３ｘ５ｍｍ，邋Ｂ５＞＜１０ｍｉｎ，邋ｄｉａｍｅｔｅｒｘｈｅｉｇｈｔ）．逡逑１．２．２邋Ｘ邋射线衍射相分析（ｐｈａｓｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｘｒａｙ邋ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，ＸＲＤ）逡逑Ｘ射线衍射分析是一种利用Ｘ射线的衍射波谱分析晶体中物质构成的技术，，逡逑其原理是沿直线运动的Ｘ射线遇到固体物质的电子后散射开来，由于不同元素逡逑含有的电子数量不同，元素会形成特征性衍射峰。不同元素的衍射峰最终会机逡逑１１逡逑

傅里叶红外,掺铈,波谱分析,梯度

Ｆｉｇ．１－１邋Ｘ－ｒａｙ邋ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ＣＳ、Ｃｅ0２、５％邋ＣＳ邋ａｎｄ邋１０％邋ＣＳ逡逑２．２梯度掺铈材料的傅里叶红外波谱分析逡逑ＣＳ、２．５％Ｃｅ－ＣＳ、５％Ｃｅ－ＣＳ和１０％Ｃｅ－ＣＳ红外波谱图见图１－２，将不同浓逡逑度掺铈硫酸钙晶体傅里叶红外波谱图与硫酸钙晶体傅里叶红外波谱图进行比逡逑较。从图１－２可以看出，５％Ｃｅ－ＣＳ和１０％Ｃｅ－ＣＳ的波谱与ＣＳ晶体的波谱基本逡逑相似，都在相同的位置产生特异性的高峰，说明添加铈元素不会影响硫酸钙晶逡逑体的内部结构、孔径及晶体组成。逡逑１０５］逦．邋＿邋？邋ｉ逦，逡逑一—邋Ｖ：邋Ｉ逡逑弋逦Ｖ．邋：：逦ＣＳ逦１逦＼＼ｆ．逡逑％逦２．５％邋Ｃｅ－ＣＳ邋逦２逡逑ｃ邋９５－逦５％邋Ｃｅ－ＣＳ邋１０％邋逦３逦．逡逑．１逦Ｃｅ－ＣＳ逦４逡逑｜邋９０－逡逑８５邋－Ｉ逦逦逦１逦■逦１逦逦逦１逦逦逡逑４０００逦３０００逦２０００逦１０００逡逑Ｗａｖｅ邋ｎｕｍｂｅｒＣｃｍ＊１）逡逑图１－２梯度掺铈材料的傅里叶红外图谱逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｆｏｕｒｉｅｒ邋ｔｒａｎｓｆｏｒｍ邋ｉｎｆｒａｒｅｄ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍ邋ｏｆ邋ＣＳ，邋Ｃｅ０２，邋５％邋Ｃｅ－邋ＣＳ邋ａｎｄ邋１０％邋Ｃｅ－邋ＣＳ．邋Ｌｉｎｅｒｌ逡逑ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ａｓ邋１０％邋Ｃｅ－邋ＣＳ，邋Ｌｉｎｅｒ２邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ａｓ邋ＣＳ，邋Ｌｉｎｅｒ３邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ａｓ邋Ｃｅ０２，邋Ｌｉｎｅｒ４邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ逡逑ａｓ邋５％邋Ｃｅ－邋ＣＳ．逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

【参考文献】