基于Alg-Gel水凝胶调控三维微环境的性能集成研究

发布时间：2020-06-26 17:47

【摘要】：研究目的:(1)改进现有生物3D打印流程和生物材料,提高3D打印效率和打印质量;(2)探究Alg-Gel生物墨水溶剂PBS的离子强度(或浓度)对生物墨水可打性和打印组织形态保持能力的影响;(3)探究Alg-Gel生物墨水溶剂PBS的离子强度(或浓度)对表皮干细胞生物学行为的影响;(4)探究双向调节Alg-Gel生物墨水溶剂PBS的离子强度和溶质明胶的浓度对表皮干细胞的干性维持和分化的作用。研究方法:(1)通过检测不同海藻酸钠原料样品的分子量分布,选择分子量均一、杂质含量较少的样品;通过检测运用不同打印温度和打印喷头进行打印后的组织中表皮干细胞的细胞活性,选择对细胞活性影响较小的打印温度和喷头。(2)检测不同溶剂的Alg-Gel生物墨水的黏度、剪切应力、储能模量以及耗能模量曲线,对生物墨水进行可打性测试,并分析物理性能与可打性的相互关系;对不同溶剂Alg-Gel生物墨水的打印组织进行体外培养,观察其表面形态并观测其形态保持能力,并分析其与生物墨水机械性能的相互关系。(3)运用Live/Dead染色检测不同溶剂的Alg-Gel生物墨水打印组织中表皮干细胞在体外培养中活细胞比例的变化;运用Ki-67染色检测表皮干细胞增殖活性的变化;运用免疫荧光染色法和RT-PCR检测表皮干细胞表达角质蛋白K5、K14、K8和K18的情况,分析其向汗腺细胞分化的情况:显微镜下观察对打印微结构内细胞聚集情况进行评估和分析。(4)运用改进后的3D打印流程测试不同溶剂离子强度和溶质浓度的Alg-Gel生物墨水的可打性,并测量不同打印组织的延展率;运用Live/Dead染色检测生物墨水中活细胞比例在体外培养过程中的变化;运用RT-PCR对不同生物墨水中表皮干细胞表达K5、K14、K8、K18、K10和E-cad的情况进行定量分析;运用显微镜对打印微结构中细胞聚集情况进行评估,并结合细胞表达marker的情况对细胞增殖和分化的情况进行分析。研究结果:(1)海藻酸钠样品C的分子量分布较集中,且实际打印组织中杂质较少;内径≥340 μm的打印喷头对细胞剪切应力较小,且对打印后细胞活性影响较小,内径340 μm的打印喷头对细胞剪切应力明显增大,且显著降低了打印后的细胞活性;打印筒温度为4℃时,活细胞比例低于50%;打印筒温度升至10℃-20℃之间时,活细胞比例明显增加;打印筒温度升至20℃以上时,活细胞比例基本维持在90%以上。打印平台温度对细胞活性影响比打印筒小,相同打印筒温度下,不同平台温度下细胞活性不变。(2)从生物墨水B-1到B-4,随溶剂离子强度的增加,Alg-Gel生物墨水的储能模量(G')明显增加,耗能模量(G")明显减小;同时,黏度(V)明显减小,剪切应力也随之减小;B-1的表面平坦,表面细胞伸展;B-2的表面呈现光滑的沟壑状,细胞伸展和分支明显;B-3和B-4表面明显变得疏松且呈颗粒状,表面的细胞不伸展或聚集成细胞团且表面被墨水包裹;在体外培养过程中,B-1和B-2打印组织基本保持了打印形态,透光性好,打印组织中的细胞清晰可见,而B-3和B-4打印组织明显膨胀,B-4膨胀更严重,镜下观察时打印组织表面呈绒毛状,透光性差,细胞影模糊,并出现了打印材料聚集和散落的现象。(3)3D打印的打印过程对细胞活性的影响较小,但随着体外培养时间的延长,细胞活性缓慢下降;体外培养过程中,细胞增殖活性下降明显,B-1增殖活性降至50%以下,B-2下降趋势较缓;B-2打印组织中细胞增殖并聚集成团现象比较明显,且在第14-28天之间,细胞团内细胞影逐渐模糊,部分形成了不规则扭曲的腺样结构;B-2打印组织中,细胞持续表达K5、K14的同时,K8和K18的表达也明显升高。(4)同时改变Alg-Gel生物墨水的溶质明胶浓度和溶剂PBS离子强度,明显影响了可打性:低浓度明胶+中、高离子强度生物墨水无法完成打印,低浓度明胶+低离子强度以及中浓度明胶+高离子强度生物墨水打印组织的延展率较高,其余生物墨水的打印组织均可以完成打印且延展率较低;改变溶质和溶剂对打印组织中细胞活性没有影响,主要影响了细胞的聚集和分化:中、高浓度明胶+中离子强度显著促进了细胞增殖和聚集,且可以在维持干性的同时促进向汗腺分化,高离子强度墨水中细胞增殖较弱,但可以稳定维持细胞干性,高浓度明胶+低离子强度墨水中细胞增殖弱,不能维持干性,但可以促进向表皮角质细胞分化。研究结论:(1)在原有3D打印流程的基础上,优选了打印喷头(340 μm)、提高了打印温度(20℃)并筛选了更适合3D打印的海藻酸钠样品(C),提高了 3D打印效率和质量。(2)初步建立通过改变溶剂PBS浓度(或离子强度)调节Alg-Gel生物墨水物理性能的方法,溶剂PBS浓度(或离子强度)越高,Alg-Gel生物墨水的黏度和硬度越低,打印组织的形态保持能力越差,综上实验结果,Alg-Gel生物墨水B-2(溶剂为0.5×PBS,离子强度0.082M)不仅具有良好的可打性,而且打印组织的膨胀率和降解率均较低,可以进行长期体外培养观察。(3)探索了 Alg-Gel生物墨水溶剂的改变对表皮干细胞生物学行为的影响。通过排除生物墨水中生物材料的种类、浓度以及溶剂种类的影响,单纯改变生物墨水溶剂的离子强度,确定了 Alg-Gel生物墨水B-2的打印组织对表皮干细胞的生物学行为具有明显的促进作用:与其他生物墨水相比,B-2明显提高了表皮干细胞的增殖活性,且在维持干性的同时,促进其向汗腺细胞分化,并且在打印组织中形成细胞聚集的腺样结构。(4)高浓度明胶(5%)可以促进表皮干细胞向表皮角质细胞分化,较高的离子强度(0.156M)可以维持表皮干细胞的干性,适中的明胶浓度和离子强度(3%,0.082M)可以在维持表皮干细胞干性的同时,促进其向汗腺细胞分化。该部分研究为含汗腺3D打印皮肤替代物模型的构建提供了充分的理论基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

再生医学,打印系统,思路

１．２结果逡逑本研宄以生物３Ｄ打印技术为基础，拟研宄生物３Ｄ打印在汗腺再生及皮肤替逡逑代物研发中的应用。如图１－１邋（Ａ）所示，挤出式生物３Ｄ打印系统目前已广泛应逡逑用于人体多种组织和器官的再生研究。在汗腺再生和皮肤替代物研发方面，基于逡逑我们实验小组已有研宄成果，本研宄将遵循如下研究思路，如图１－１邋（Ｂ）所示：逡逑１．改进操作流程以提高打印效率和打印质量；２．改进生物墨水以适应细胞行为和组逡逑织发生；３．创新皮肤替代物构建方法以适应临床需求。为实现以上目标，我们首先逡逑对己有的生物３Ｄ打印操作流程进行了改进，为之后的生物墨水和皮肤替代物模型逡逑研宄奠定了重要的基础。逡逑■１＾逡逑ｙｊＢＢＢｉｉｉｉ＃＇＇＇邋ｎ邋ＫＨＩＢ逡逑Ｂ逡逑（Ｇｅｌ－Ａ？逦}0＿ｉ逦ｂｉｏｐｒｉｍｉｎｇ逦逦逡逑澯逦｜—R釴．逡逑Ｂｉｏ－ｆａｃ．ｏｒ＊ｒ．：Ｖ邋＂逦Ｔ逦＾逡逑（ＰＤ）逦Ｂｉｏｉｎｋ逦择孑逡逑Ｉ邋Ｃｕｌａｉｒｅ逡逑？ｕｉｖｉ，ｒｏ逡逑．４■扢．逡逑图１－１．挤出式生物３Ｄ打印系统的组成及生物３Ｄ打印在再生医学中的应用思路。（Ａ）挤出式逡逑生物３Ｄ打印系统的组成；（Ｂ）生物３Ｄ打印在再生医学中的应用思路。逡逑１．２．１生物３Ｄ打印喷头对细胞活性的影响逡逑２２逡逑

喷头,细胞活性,统计学意义

相同打印墨水和相同打印速度的前提下，打印喷头的内径越小，打印时所需要的逡逑气压就越大；由于打印条的直径不同，因此打印组织的孔径大小差异明显，打印逡逑喷头的内径越小，打印组织的孔隙率就越大。如图１－２邋（Ａ）所示，在使用鼠表皮逡逑干细胞作为种子细胞时，三种内径的喷头打印后即刻（Ｄ０）组织中表皮千细胞的逡逑活性有明显的差异：２１０邋ｙｍ喷头打印的活细胞比例为８５．２％，明显低于３４０邋ｕｍ逡逑和４２０邋ｕｍ喷头打印后的活细胞比例（均＞９０％），差异有统计学意义０＜0．0５），逡逑３４０邋ｕ邋ｍ和４２０邋Ｗ邋ｍ喷头打印后的活细胞比例之间的差异没有统计学意义（ｐ＞０．０５）。逡逑如图１－２邋（Ｂ）所示，表皮干细胞在经过三种不同打印喷头时所受到的剪切应力明逡逑显不同：２１０邋ｕｍ喷头对细胞的剪切应力最大，明显高于３４０邋ｕｍ和４２０邋ｕｍ喷头，逡逑差异有统计学意义（ｐ＜０．０１）；邋３４０邋ｕｍ喷头对细胞的剪切应力稍大于４２０ｕｍ喷逡逑头，二者差异没有统计学意义（／？＞0．0５）。逡逑Ａ逦ｇ逦ｍｉ逡逑１０－Ｔｔ逦逦逦．逦逦逦１逦逦逦ｒ５００逡逑１００１逦ｍ邋ｄｉ逦ｌ逦，逡逑１邋ｉｉｉｉｉｉ邋ｉｉｉｉｉｉ逡逑２１０｜ｊｍ逦３４０Ｍｍ逦４２０ｐｍ逦逦＇逦＾逦逦＾￣４

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