三维联通纳米氧化锆支架改性及附着LMP-1过表达hDPSCs的研究

发布时间：2020-08-12 21:35

【摘要】：龋病、外伤、牙周病等均可能导致牙齿的缺损或缺失,牙齿自我修复缺损的能力非常有限,目前牙齿缺损修复方法虽然较多,但均存在着各种不足。组织工程技术利用干细胞多向分化潜能的特性,复合支架材料修复缺损组织和器官,是再生医学研究的热点。课题组在前期的实验研究中成功制备出了机械强度高,孔隙率大小合适的三维联通纳米氧化锆支架,可以作为组织缺损修复的支架材料。但是前期在支架制备的过程中发现支架首次烧结成型率有待提高。氧化锆虽然具有良好的生物相容性和机械性能,但是其与细胞和组织亲和力欠佳。RGD多肽是由3个氨基酸构成的短肽,可以促进细胞黏附、增殖和分化。人牙髓干细胞(hDPSCs)是位于牙髓组织中的一种间充质干细胞,在一定的诱导环境下具有多向分化能力,并具有来源广泛、取材方便等优点。hDPSCs的成牙本质向分化是牙齿生长发育和牙髓组织损伤修复的关键环节之一,其过程受多种生长因子和信号通路调控,具体机制尚未完全明了。LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是一种具有成骨诱导活性的细胞内非分泌蛋白,在矿化过程中起正向调节作用,大量研究表明LMP-1在生长发育和受外界刺激牙齿的牙髓组织、成牙本质细胞及修复性牙本质中有着不同程度的表达,但是其在hDPSCs成牙本质方向分化过程中的作用和机制目前尚无相关的报道。本研究旨在通过改进氧化锆支架烧结工艺,表面修饰改性,进一步完善支架的载体性能。探讨LMP-1在hDPSCs成牙本质方向分化过程中的作用,为hDPSCs成牙本质方向分化提供新的思路和方法,初步观察复合RGD多肽的氧化锆支架对LMP-1过表达hDPSCs黏附、增殖和分化的影响,探讨其对牙齿缺损修复及应用到组织工程的可行性。实验方法和结果:1、三维联通纳米氧化锆支架性能优化本研究通过延长支架烧结过程中1360℃到1060℃冷却时间,发现随着冷却时间的不断延长,支架烧结成型率明显提高。且SEM观察随着冷却时间的延长,支架梁柱上的裂纹数量和长度明显减少;通过对支架进行Micro-CT扫描重建和压缩强度测试,发现冷却时间超过8h后,支架的平均小梁数目和小梁平均厚度以及压缩强度显著高于其他组。通过FTIR分析RGD多肽能够通过共价键良好固定在支架表面,CCK-8检测发现通过RGD修饰能促进细胞在支架上的初期黏附。2、hDPSCs的分离、纯化、培养与鉴定本实验通过组织块结合酶消化法从人牙髓组织中分离培养出原代细胞,再经有限稀释法挑选单克隆进行细胞纯化和传代扩大培养,通过克隆形成能力检测细胞具有较强克隆集落形成能力;流式细胞仪检测细胞表面高表达间充质干细胞表面标志物,阴性表达造血细胞表面标记物;经成骨/成牙本质方向诱导分化和成脂方向诱导分化后染色均呈阳性。证明成功分离培养出了hDPSCs。3、LMP-1对hDPSCs增殖和分化能力的影响本实验利用基因工程技术构建慢病毒和逆转录病毒载体,能够高效感染hDPSCs,稳定沉默和过表达hDPSCs中LMP-1,通过CCK-8检测细胞的增殖能力,发现LMP-1基因沉默和过表达对hDPSCs的增殖能力无明显影响;沉默hDPSCs中LMP-1表达,细胞矿化结节形成能力明显减弱,通过qRT-PCR和Western Blot检测发现ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白的表达也不同程度降低;而过表达LMP-1后,细胞矿化结节形成能力增强,ALP、DSPP、DMP-1的mRNA和蛋白表达也显著增加。4、三维联通纳米氧化锆支架附着LMP-1过表达hDPSCs的体外研究本研究将前期性能优化的支架作为载体,附着LMP-1过表达的hDPSCs培养,观察细胞能够在支架上良好的黏附和增殖;通过CCK-8实验发现100mg/L的RGD多肽能更好的促进细胞在氧化锆支架上的黏附和增殖。通过ALP活性检测,观察到复合RGD多肽的纳米氧化锆支架对LMP-1过表达hDPSCs的成骨/成牙本质方向分化有协同作用。综上所述,本研究通过改进支架烧结流程,延长冷却时间,明显改善了支架烧结的首次成型率,且提高了支架强度;使用RGD多肽修饰支架后增加了支架的亲水性,提高了支架的细胞初期黏附能力;成功分离鉴定培养出了hDPSCs,沉默或过表达hDPSCs中LMP-1的表达,对细胞增殖能力无明显影响,LMP-1沉默可抑制hDPSCs的成牙本质方向分化,而过表达LMP-1可促进hDPSCs的成牙本质方向分化;100mg/L的RGD多肽修饰的支架能促进LMP-1过表达hDPSCs的黏附、增殖和分化,为下一步体内实验进行提供了有效基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R783.1
【图文】：

空军军医大学硕士学位论文孔三维联通空间结构。在对照组（冷却时间 1h）中，烧结出的支架周围均可见落的氧化锆支架颗粒，时有支架整体结构破坏，出现断裂、坍塌等情况；随着时间的不断延长，支架周围脱落颗粒明显减少，在冷却时间≥8h 组均未见明显脱颗粒，且各实验组中均未见到支架整体结构破坏现象（图 1.1）。

空军军医大学硕士学位论文孔三维联通空间结构。在对照组（冷却时间 1h）中，烧结出的支架周围均可见落的氧化锆支架颗粒，时有支架整体结构破坏，出现断裂、坍塌等情况；随着时间的不断延长，支架周围脱落颗粒明显减少，在冷却时间≥8h 组均未见明显脱颗粒，且各实验组中均未见到支架整体结构破坏现象（图 1.1）。

-24-图 1.2 不同冷却时间纳米氧化锆支架 SEM 观察.3 纳米氧化锆支架 Micro-CT 扫描通过对支架进行 Micro-CT 扫描重建，我们可以清楚看到支架之间具有良好隙结构，支架孔隙率高，孔径大小在 600-800μm 之间（图 1.3A）。Micro-CT 分析显示冷却时间≥8h 的实验组平均小梁数量显著高于对照组（5），组间无明显差异（p＞0.05）（图 1.3B）；小梁平均厚度分析显示：冷却 6h 组以及≥8h 组的小梁平均厚度都明显高于对照组（分别为 p＜0.05，p＜0却时间 4h 和 6h 组之间，8h、10h、12h 组间无明显差异（p＞0.05）（图 1.

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本文编号：2791054