镍钛合金复合仿生界面的构建及其生物学功能研究

发布时间：2020-09-10 12:10

　　心血管疾病是全球第一大致死原因,其中动脉粥样硬化是最常见的心血管病致病因素之一。支架植入术具有创伤小、治疗效果显著的优势而被广泛运用在动脉粥样硬化的治疗中。血管支架经历了从裸金属支架到药物缓释支架再到可降解支架的发展,有效改善短期血栓引起的再狭窄情况,然而支架植入后晚期血栓的形成以及再狭窄等并发症仍然存在着巨大挑战。由于血管支架植入过程不可避免造成内皮细胞损伤,引起内皮细胞功能失衡,导致血管平滑肌细胞增殖速度过快从而引起再狭窄。而支架表面内皮化不完全是诱发晚期血栓的主要原因。目前认为提高内皮细胞功能赋予支架表面快速再内皮化进程能够有效降低再狭窄与晚期血栓形成。为了实现支架植入后表面快速内皮再生,研究者主要采用了三种表面改性策略。早期是通过直接在支架表面种植内皮细胞促进内皮化进程,然而由于血液流动导致细胞难以维持黏附,因此内皮化程度较低;接着通过在支架表面固定生物功能分子促进内皮细胞迁移,一定程度上促进了内皮化进程,然而严重依赖支架植入处内皮细胞的迁移过程;后来通过在血管支架表面固定内皮祖细胞捕获分子实现支架自发诱导内皮化,由于难以控制内皮祖细胞分化过程,导致临床试验效果不理想。在天然血管结构中,内皮细胞附着的内皮下层基底膜具有微米级的沟槽拓扑结构,而且表面具有纳米尺度的突起,形成血液-血管内膜间的多尺度微纳复合结构界面。基于此,研究者在不同血管支架材料表面加工构建了不同尺寸微纳米拓扑结构仿生血管内皮下层基底膜复杂的三维拓扑结构,以期促进支架表面内皮化进程。然而仅仅通过拓扑结构仿生只能部分模拟体内内皮细胞生长微环境,基底刚度这一重要的血管内膜界面力学因素往往被忽略。体内正常血管内皮下层基底刚度约30 kPa,金属血管支架弹性模量达到GPa数量级。已有文献报道表明基底刚度能够调控内皮细胞重要功能因子分泌过程,因此为了保证血管支架植入后内皮细胞功能正常发挥,内皮细胞基底刚度也是支架设计过程中极其重要的因素之一。基于此,本论文提出一个综合拓扑结构与基底刚度两个重要生物界面因素的支架表面改性方法:通过离子束刻蚀在医用镍钛合金血管支架材料表面构建微米沟槽仿生内皮下层条纹趋向的拓扑结构,通过光聚合水凝胶技术在沟槽拓扑结构表面形成水凝胶涂层仿生内皮下层基底刚度。本论文研究目的是综合拓扑结构与基底刚度两个重要生物界面因素在血管支架表面仿生构建血管内膜生物界面,促进内皮细胞功能,同时能够抗血小板黏附与激活,以期减少再狭窄与晚期血栓的发生。论文主要内容如下:首先通过光刻与离子束刻蚀在医用镍钛合金表面构建微米沟槽拓扑结构,进一步利用光聚合技术在沟槽拓扑结构表面形成聚乙烯膦酸-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(P(VPA-co-MBAA))共聚物水凝胶涂层形成复合仿生界面。通过扫描电子显微镜和原子力显微镜表征发现,沟槽拓扑结构呈棱台状,沟槽顶部宽度约为2μm,底部宽度约6μm,高度约800 nm。利用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪表征共聚物水凝胶化学结构,结果表明水凝胶涂层构建成功。原子力显微镜表征结果表明,构建水凝胶涂层后沟槽拓扑结构仍然保留,弹性模量相比光滑镍钛合金从GPa数量级下降至MPa,一定程度上降低了血管支架表面弹性模量,复合仿生界面更加接近生理状态内皮下层基底膜刚度。在此基础上,通过表面培养内皮细胞和平滑肌细胞评价复合仿生界面细胞增殖能力,CCK-8实验结果表明复合仿生界面沟槽拓扑结构选择性抑制平滑肌细胞增殖,不影响内皮细胞的正常增殖能力,有助于防止再狭窄的发生。通过提取复合仿生界面培养内皮细胞RNA,探究复合仿生界面对内皮细胞重要功能基因表达和重要功能因子分泌影响,qPCR实验结果表明复合仿生界面水凝胶涂层促进内皮细胞功能基因PGIS表达及PGI_2分泌,抑制ET-1基因表达及ET-1分泌,对eNOS基因表达水平和NO分泌水平没有显著影响。细胞迁移实验结果表明复合仿生界面促进内皮细胞迁移,而且对内皮细胞迁移的促进作用强于平滑肌细胞。综上,复合仿生界面相比光滑镍钛合金促进内皮细胞功能,同时促进内皮细胞的迁移过程,有助于支架表面快速再内皮化。血液相容性评价结果表明复合仿生界面具有抗血小板黏附与激活能力,有助于防止血栓形成。作为植入性医疗器械,复合仿生界面溶血率为0.51%,远远小于国际标准规定的5%,具有优良的血液相容性。综上,本研究以医用血管支架材料镍钛合金为研究对象,通过离子束刻蚀构建微米沟槽拓扑结构,进一步利用光聚合技术构建水凝胶涂层形成复合仿生界面。体外实验研究结果表明,与光滑镍钛合金相比,复合仿生界面能够促进内皮细胞PGI_2分泌,抑制ET-1分泌,一定程度上改善内皮细胞功能。同时,复合仿生界面能够促进内皮细胞迁移,有助于支架表面快速再内皮化。体外血液相容性实验研究结果表明,复合仿生界面能够有效抗血小板黏附与激活,有助于防止血栓形成。综合来看,本研究能够为血管支架等植入性医疗器械表面仿生改性提供新的参考。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

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图 1.1 血管结构示意图[47]1.4.2 拓扑结构仿生改性在天然血管中，内皮细胞层受到基底膜复杂三维拓扑结构与血液流动影着拓扑结构和血液流动方向分布，细胞形态呈现长梭型，长轴延伸方向与拓和血流方向平行。内皮下层基底膜具有微米级的沟槽拓扑结构，而且表面具尺度的突起，形成血液-血管内膜间的多尺度微纳复合结构界面[53]。Youdo等人利用原子力显微镜观察大鼠动脉血管内壁发现，存在微米沟槽拓扑结纳米突起，如图 1.2 所示[54]。基于此，研究者在不同血管支架材料表面加工不同尺寸微纳米拓扑结构仿生血管内皮下层基底膜复杂的三维拓扑结构，进支架表面内皮化进程。Jingan Li 等人通过在钛基底表面刻蚀不同脊沟比微米拓扑结构，促进表面培养的内皮细胞一氧化氮 NO 释放和前列环素 PG[55]。Sprague,E.A.等人通过在316L不锈钢支架内表面刻蚀 15 微米沟槽拓扑发现沟槽拓扑结构支架能够显著促进内皮细胞的迁移过程[56]。此外，也有

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图 1.2 原子力显微镜下大鼠动脉血管内壁结构图[54]1.5 水凝胶1.5.1 水凝胶定义及分类水凝胶是一种具有三维网络状结构的亲水聚合材料。在水溶液中，能够吸收大量的水分膨胀至自身原体积的 100 多倍，同时具有维持流体在其三维交联网络结构中的趋势。由于具有良好的生物相容性与良好的降解性能[60]，水凝胶被广泛运用于组织工程、载药系统以及药物控释系统[61]等生物医药研究中。在水凝胶网络中，亲水基团与水分子结合，疏水基团发生溶胀交联形成高分子聚合物[62]，因此水凝胶材料弹性良好、快速吸水和高度亲水等优点受到研究者的广泛青睐。根据不同的原料可以将水凝胶分为三类：天然高分子水凝胶、人工合成水凝胶和复合水凝胶[60]。天然高分子水凝胶是由胶原、明胶、透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、纤维蛋白等天然高分子物质及其衍生物制备形成的。人工合成水凝胶就是由人工合成的高分子物质交联形成的水凝胶，包括聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚乙

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军事科学院硕士学位论文培养基中的 NO、ET-1 和 PGI2水平。评价复合仿生界面培养的平滑肌细胞增殖与迁移能力。（3）在平行板流动小室模拟动态血流剪切力作用条件下，检测复合仿生界面血小板黏附与激活情况。测定复合仿生界面溶血率。本文研究技术路线图如下。

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