基于新锁定策略的金纳米氨基配体相关蛋白环冠复合物分析

发布时间：2020-10-11 05:10

　　 研究背景金纳米颗粒(GNPs)作为一类重要的材料,具有细胞毒性低、化学稳定性好、易于合成和功能化等优点。近年来,金纳米颗粒在疾病诊断和治疗方面已经显示出巨大的潜力。为特定的应用,GNPs通常采用各种生物学配体进行功能化,包括氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等携带氨基的配体。一旦进入生物体液,GNPs将被蛋白质包裹,所形成的蛋白环冠会在空间上阻碍配体的靶向性功能。以前的研究通常采用标准离心法或蔗糖垫离心法来制备和分析蛋白环冠。然而,这些方法均不适用于对配体结合的蛋白环冠进行特异分析。由此,我们提出一种新锁定策略对金纳米氨基配体所结合的环冠复合物进行蛋白质组学分析。方法1.含半胱氨酸配体连接GNPs的合成与表征:取适量的氯金酸溶解在超纯水中,按比例先后加入二水柠檬酸钠和L-半胱氨酸,通过过滤得到含半胱氨酸的GNPs,使用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征分析。2.人血浆样本的采集:通过静脉刺穿的方法采集正常志愿者的血液样品,通过离心分离,得到血浆。3.蛋白环冠的形成和分离:将半胱氨酸连接的GNPs与血浆在37℃的恒温箱中震荡孵育得以充分结合,之后用三种不同的处理方法进行分离得到蛋白环冠,即常规方法标准离心法(方法I),蔗糖垫缓冲离心法(方法II),以及我们所提新方法(方法III):先采用甲醛进行快速交联,并对甲醛浓度和交联时间进行摸索,在最佳交联浓度和时间的条件下,经过严厉的洗涤将与半胱氨酸结合的蛋白环冠与GNPs表面结合的蛋白环冠进行有效分离,最终得到配体相关环冠复合物。4.定量蛋白质组学分析:将三种方法所得蛋白质溶液煮沸,其中甲醛交联的样品被煮沸20分钟以破坏蛋白间化学交联,采用SDS-PAGE将蛋白质样品浓缩于短胶中,胶内酶解后,采用液-质联用质谱检测(LC-MS/MS)对酶解肽段进行检测,蛋白质搜库后进行生物信息学分析和统计分析,对三种方法的蛋白质谱进行非标定量比较。5.蛋白环冠位点的解析:将未煮沸的甲醛交联样品采用SDS-PAGE进行分离,切取条带并进行胶内酶解后,进行质谱检测。在Mascot搜索中设置可变修饰,其中将半胱氨酸标记作为可变修饰以便进行位点解析。结果1.TEM结果显示,所合成的半胱氨酸连接金纳米颗粒大小均一,约为17nm。2.GNPs与人血浆形成蛋白环冠后,使用甲醛快速交联,通过浓度和时间摸索,我们发现甲醛快速交联所需浓度为7.5%,所用交联时间为5秒。3.通过质谱检测,方法I,II和III所得蛋白环冠中,分别有295±12,298±20和217±5个蛋白质被鉴定。总体而言,三种方法的所有蛋白质显示出相似的MW,pI和GRAVY分布图。相比于方法I和II,方法III中环冠蛋白质具有不同的理化性质和独特的生理分子功能,表明该方法所得蛋白环冠是半胱氨酸配体结合的特有成分。4.在位点解析中,共有456个蛋白质被鉴定,经STRING分析产生302个相互作用的蛋白和8572个相互作用的位点,表明半胱氨酸配体结合的环冠是一个较为庞大的蛋白质互作网络。另外,通过质谱检测,我们还发现有11个蛋白质直接与半胱氨酸存在相互作用,为解析环冠如何阻挡配体功能提供了重要的直接证据。结论本研究所建立的新方法能有效捕捉到半胱氨酸配体结合的蛋白环冠复合物,联合蛋白质组学技术为GNPs中氨基类配体所结合的蛋白环冠分析提供了一种通用策略,也为解析环冠如何掩蔽配体功能提供了方法学工具和直接证据。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

14图 1. 三种不同方法制备蛋白环冠的流程图。Figure 1. Flow chart of the three different methods for proteomic analysis of the goldnanoparticle (GNP) corona.1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品与 2×凝胶上样缓冲液混合，方法 I 和方法 II 的样品在 95℃条件下加热 5min，方法 III 所得样品加热 20min 以逆转甲醛交联[41]。每个蛋白样品取 10μg 在由 3 层组成的垂直聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳[47]，凝胶包括 4%堆积胶，长约 1cm 的 10%分离胶和 50%阻隔胶。电泳条件为：恒压 80V，20 min，120 V，1 h。电泳完成后，取下凝胶，固定液固定 1 小时，弃去固定液，ddH2O

图 2. 在半胱氨酸附着的金纳米颗粒（GNPs）和环冠蛋白之间的甲醛交联反应方案和相应的用于质谱（MS）的蛋白质鉴定的可变修饰。Figure2. Reaction scheme (A or B) of formaldehyde crosslinking between cysteine-attachedgold nanoparticles (GNPs) and corona proteins and the corresponding variable modificationfor mass spectrometry (MS)-based protein identification.1.3.11 生物信息学和统计分析利用 PI/MS 工具计算蛋白质的等电点和分子量，使用 ProtParam 工具程序估计蛋白质的 GRAVY[50]。蛋白质生理功能的划分根据 UniProt 的注释和 IntegratedDiscovery 6.7 生物信息学工具[51]。蛋白质相互作用网络由 STRING 工具检索，检索参数设置为中等置信度（STRING score= 0.4）[52]。使用 Cytoscape-PluginMCODE 软件对网络中几个高度连接的区域进行进一步分析[41,53]。对于数据的统计分析，使用 SPSS 软件进行单因素方差分析（ANOVA），然后进行事后最小显著性差异检验，P 值小于 0.05 被认为具有显著差异[49]。

3. 半胱氨酸附着金纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像和尺寸分布直方图。e 3. Transmission electron microscopy (TEM) image and size distribution histogramcysteine-attached gold nanoparticles (GNPs) used in the present study.甲醛快速交联的最佳条件交联时间一定，甲醛交联的浓度为 7.5%及以上浓度时，蛋白条带没有，表明 7.5％足以固定 GNP-蛋白质相互作用（图 4A）。当甲醛交联浓度时，可观察到在使用较长反应时间获得的蛋白条带没有明显差异，表明时间足够（图 4B）。因此，快速固定半胱氨酸结合蛋白环冠的最佳交联7.5％，交联时间为 5s。
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本文编号：2836116