HP-HA-肝ECM水凝胶制备及细胞相容性研究

发布时间：2020-10-29 16:12

　　 目的:研究肝素-透明质酸-肝脏细胞外基质水凝胶(HP-HA-肝ECM水凝胶)的制备方法及细胞相容性。方法:切取新鲜大鼠肝脏组织,使用冻融法、TritonX-100洗涤及胃蛋白酶溶解结合机械震荡法进行脱细胞制备,HE染色法及DAPI染色法对其脱细胞效果进行检测。将脱细胞后的肝脏ECM交联肝素-透明质酸水凝胶,制备HP-HA-肝ECM水凝胶。利用CCK8法和Live/Dead细胞染色法进行HP-HA-肝ECM水凝胶与下颌下腺细胞相容性检测。结果:HP-HA-肝ECM水凝胶使下颌下腺细胞增殖活性升高,死细胞比率降低。结论:HP-HA-肝ECM水凝胶支架材料具有良好的细胞相容性。
【部分图文】：

图1肝脏脱细胞前后的比较(×100)Fig1Comparisonofthelivertissuebeforeandafterdecellulariza-tion(×100)经过脱细胞化、冻干、冰冻研磨、胃蛋白酶溶解后得到的胶状肝ECM成分(图2A)。该成分外观通透，无肉眼可见杂质，无明显异味(图2B)。成品肝素－透明质酸水凝胶，初始为均质白色固态，待完全溶解后为透明状液体。将两者交联得到HP-HA-肝ECM水凝胶，无色无味透明状，稍黏稠，30min完全成为凝胶状态(图2C)，分别包被于96孔板和48孔板中(图2D～E)。2．3新生SD大鼠下颌下腺细胞的形态学特征原代培养第3天可见典型的上皮细胞贴壁，第4天时可见少量成纤维细胞，采用差速贴壁法去除成纤维细胞后可得到形态较为一致的下颌下腺细胞，第5天时于显微镜下观察见细胞呈多角形，边界清晰，排列呈鹅卵石样外观;培养至第14天时，可见细胞排列紧密，呈铺路石状，胞浆丰富，可见分泌颗粒(图3)。培养第14天时第1次传代。图2肝ECM成分的获取及交联Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink图3原代培养的SD大鼠下颌下腺细胞形态(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4体外培养SD大鼠下颌下腺细胞免疫学鉴定以α-淀粉酶和CK7作为下颌下腺细胞的标记蛋白。α-淀粉酶和CK7阳性表达的表现是下颌下腺细胞胞膜及胞质呈绿色荧光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫荧光染色和CK7免疫细胞化学染色结果PBS液作为阴性对照。第2代SD大鼠下颌下腺细胞阳性表达α-淀粉酶、CK7标记蛋白。对照组结果阴性(图4)。图4SD大鼠下颌下腺细胞α-淀粉酶和CK7免疫学鉴定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下颌下腺细胞在HP-HA-肝ECM水

图1肝脏脱细胞前后的比较(×100)Fig1Comparisonofthelivertissuebeforeandafterdecellulariza-tion(×100)经过脱细胞化、冻干、冰冻研磨、胃蛋白酶溶解后得到的胶状肝ECM成分(图2A)。该成分外观通透，无肉眼可见杂质，无明显异味(图2B)。成品肝素－透明质酸水凝胶，初始为均质白色固态，待完全溶解后为透明状液体。将两者交联得到HP-HA-肝ECM水凝胶，无色无味透明状，稍黏稠，30min完全成为凝胶状态(图2C)，分别包被于96孔板和48孔板中(图2D～E)。2．3新生SD大鼠下颌下腺细胞的形态学特征原代培养第3天可见典型的上皮细胞贴壁，第4天时可见少量成纤维细胞，采用差速贴壁法去除成纤维细胞后可得到形态较为一致的下颌下腺细胞，第5天时于显微镜下观察见细胞呈多角形，边界清晰，排列呈鹅卵石样外观;培养至第14天时，可见细胞排列紧密，呈铺路石状，胞浆丰富，可见分泌颗粒(图3)。培养第14天时第1次传代。图2肝ECM成分的获取及交联Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink图3原代培养的SD大鼠下颌下腺细胞形态(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4体外培养SD大鼠下颌下腺细胞免疫学鉴定以α-淀粉酶和CK7作为下颌下腺细胞的标记蛋白。α-淀粉酶和CK7阳性表达的表现是下颌下腺细胞胞膜及胞质呈绿色荧光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫荧光染色和CK7免疫细胞化学染色结果PBS液作为阴性对照。第2代SD大鼠下颌下腺细胞阳性表达α-淀粉酶、CK7标记蛋白。对照组结果阴性(图4)。图4SD大鼠下颌下腺细胞α-淀粉酶和CK7免疫学鉴定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下颌下腺细胞在HP-HA-肝ECM水

水凝胶，初始为均质白色固态，待完全溶解后为透明状液体。将两者交联得到HP-HA-肝ECM水凝胶，无色无味透明状，稍黏稠，30min完全成为凝胶状态(图2C)，分别包被于96孔板和48孔板中(图2D～E)。2．3新生SD大鼠下颌下腺细胞的形态学特征原代培养第3天可见典型的上皮细胞贴壁，第4天时可见少量成纤维细胞，采用差速贴壁法去除成纤维细胞后可得到形态较为一致的下颌下腺细胞，第5天时于显微镜下观察见细胞呈多角形，边界清晰，排列呈鹅卵石样外观;培养至第14天时，可见细胞排列紧密，呈铺路石状，胞浆丰富，可见分泌颗粒(图3)。培养第14天时第1次传代。图2肝ECM成分的获取及交联Fig2Thepreparationofliverdecellularizedextracellularmatrixandcrosslink图3原代培养的SD大鼠下颌下腺细胞形态(A:×200;B:×400)Fig3PrimarylyculturedsubmandibularglandcellsofSDrat(A:×200;B:×400)2．4体外培养SD大鼠下颌下腺细胞免疫学鉴定以α-淀粉酶和CK7作为下颌下腺细胞的标记蛋白。α-淀粉酶和CK7阳性表达的表现是下颌下腺细胞胞膜及胞质呈绿色荧光染色和棕色染色。α-淀粉酶免疫荧光染色和CK7免疫细胞化学染色结果PBS液作为阴性对照。第2代SD大鼠下颌下腺细胞阳性表达α-淀粉酶、CK7标记蛋白。对照组结果阴性(图4)。图4SD大鼠下颌下腺细胞α-淀粉酶和CK7免疫学鉴定(×400)Fig4Immunologicalidentificationofα-amylaseandCK7inSMGCs(×400)2．5下颌下腺细胞在HP-HA-肝ECM水凝胶中的增殖情况实用口腔医学杂志(JPractStomatol)2019Nov，35(6)·187·
【参考文献】

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【共引文献】

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本文编号：2861145