人体脱细胞脂肪组织的制备及组织学评价
发布时间：2021-03-09 03:19
目的通过为人体吸脂来源的脂肪组织脱细胞,评估脱细胞脂肪组织的组织学成分,探讨其作为组织工程支架材料的可能性。方法采用改良的脱细胞方法为5例人吸脂来源的脂肪组织脱细胞,观察制备过程的大体形态,对脱细胞脂肪进行HE染色、Masson染色、Gomori染色、油红O染色、DAPI染色,并对脱细胞组织中残留的DNA、胶原蛋白及糖胺聚糖含量进行定量检测。结果本实验制备的脱细胞脂肪,外观呈不透明的乳白色,无固定形态。HE染色和DAPI染色无可见细胞成分残留,Masson染色可见胶原纤维,Gomori染色可见网状纤维存在,油红O染色无可见脂质残留。组织中残留的DNA含量微小,胶原和糖胺聚糖含量均有所保留。结论应用结合物理化学和酶学的脱细胞方法,可以为人体的吸脂来源脂肪组织脱细胞,得到的脱细胞组织去除了脂肪组织中的细胞及脂质成分,保留了脂肪组织细胞外基质的组成成分。
【文章来源】：解剖学报. 2020,51(01)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
脂肪和DAT中胶原及GAG含量检测与脂肪组对比，*P<0.05;**P<0.01
图1 人脂肪组织脱细胞过程的大体形态通过对比正常脂肪组织和DAT的组织学染色，可以观察到在HE染色中，脂肪组织细胞排列成蜂巢状，细胞结构完整，呈空泡形，细胞核位于一侧(图2A)。而DAT则丧失了脂肪组织的正常结构，呈现为一种无序的纤维排列，这些结构是由丝状的纤维成分彼此交织而成，视野中看不到任何细胞存在的痕迹(图2B)。Masson染色中可以看到大量胶原纤维的存在，这些胶原纤维是构成DAT的主要成分，它们彼此交织成有空隙的条索(图2D)。Gomori染色结果显示，脱细胞后网状纤维的成分被保留下来(图2F)。DAPI染色后，荧光显微镜下观察，在DAT中未见代表细胞核的蓝色荧光点(图2H)，而在脂肪组织中，能明显看到大量蓝色荧光点的存在(图2G)。油红O染色提示，在DAT中无明显脂质成分残留(图2J)。采用Quant-PicoGreen DNA检测试剂盒对DAT中残余DNA含量进行定量检测，结果为(9.26±2.85)mg/kg干重，符合Gilbert提出的关于脱细胞组织中DNA含量<50 mg/kg干重的评价标准。各种脱细胞方法都不能完全去除全部细胞成分，在已获得临床应用的ECM材料中仍能检测到微量DNA片段的存在，鉴于其在临床上的成功应用，说明残余的DAN片段不会引起机体的排斥反应。而本研究提取的DAT是否具有良好的细胞和组织相容性，仍需在进一步实验中验证。检测5组供体的新鲜脂肪及DAT中的胶原蛋白含量(图3)，结果为DAT中胶原蛋白含量为(371.57±62.02)g/kg干重，脂肪组织中的胶原蛋白含量为(416.68±63.88)g/kg干重。检测5组供体的DAT和新鲜脂肪的GAG的含量，结果分为(4.88±0.77)g/kg干重和(8.00±1.05)g/kg干重。表明经过一系列脱细胞处理后，DAT中保留了相当数量的胶原蛋白和GAG，但较脱细胞前有不同程度的减少，表明我们所采用的脱细胞方法在有效去除细胞和脂质的同时，对细胞外基质的成分有一定的损耗，但胶原蛋白和GAG含量的减少是否会对DAT的生物学活性产生比较大的影响，仍需在进一步的实验中进行检测。提取的脂肪细胞外基质能否作为三维打印支架的来源也需要在进一步的实验中进行检测[5]。
实验中可以观察到，将吸脂后得到的脂肪组织(图1A)，经高低渗透压液体反复浸泡振荡及多次冻融循环后，可见脂肪颜色变浅，类糜状，表面有大量脂滴漂浮(图1B)。组织经匀浆离心后可分为3 层，上层为细胞破坏后分离出来的游离脂质，中层为残余的脂肪，底层的白色絮状物为所要提取的物质(图1C)。将全部的白色沉淀收集起来，分别加入到triton X-100、异丙醇和含有DNA酶和RNA酶的高渗氯化钠中振荡，再次离心后，最终得到一种类似胶原的乳白色的软体物质，具有一定的体积及韧性(图1D)。提取组织体积约占脱细胞前脂肪体积的1/10，提示在脂肪组织中，细胞和油脂成分占更大的比重，因而在去除了细胞和脂质成分后，DAT体积有了明显缩小。图2 脂肪和DAT的组织学染色
本文编号：3072157
【文章来源】：解剖学报. 2020,51(01)北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
脂肪和DAT中胶原及GAG含量检测与脂肪组对比，*P<0.05;**P<0.01
图1 人脂肪组织脱细胞过程的大体形态通过对比正常脂肪组织和DAT的组织学染色，可以观察到在HE染色中，脂肪组织细胞排列成蜂巢状，细胞结构完整，呈空泡形，细胞核位于一侧(图2A)。而DAT则丧失了脂肪组织的正常结构，呈现为一种无序的纤维排列，这些结构是由丝状的纤维成分彼此交织而成，视野中看不到任何细胞存在的痕迹(图2B)。Masson染色中可以看到大量胶原纤维的存在，这些胶原纤维是构成DAT的主要成分，它们彼此交织成有空隙的条索(图2D)。Gomori染色结果显示，脱细胞后网状纤维的成分被保留下来(图2F)。DAPI染色后，荧光显微镜下观察，在DAT中未见代表细胞核的蓝色荧光点(图2H)，而在脂肪组织中，能明显看到大量蓝色荧光点的存在(图2G)。油红O染色提示，在DAT中无明显脂质成分残留(图2J)。采用Quant-PicoGreen DNA检测试剂盒对DAT中残余DNA含量进行定量检测，结果为(9.26±2.85)mg/kg干重，符合Gilbert提出的关于脱细胞组织中DNA含量<50 mg/kg干重的评价标准。各种脱细胞方法都不能完全去除全部细胞成分，在已获得临床应用的ECM材料中仍能检测到微量DNA片段的存在，鉴于其在临床上的成功应用，说明残余的DAN片段不会引起机体的排斥反应。而本研究提取的DAT是否具有良好的细胞和组织相容性，仍需在进一步实验中验证。检测5组供体的新鲜脂肪及DAT中的胶原蛋白含量(图3)，结果为DAT中胶原蛋白含量为(371.57±62.02)g/kg干重，脂肪组织中的胶原蛋白含量为(416.68±63.88)g/kg干重。检测5组供体的DAT和新鲜脂肪的GAG的含量，结果分为(4.88±0.77)g/kg干重和(8.00±1.05)g/kg干重。表明经过一系列脱细胞处理后，DAT中保留了相当数量的胶原蛋白和GAG，但较脱细胞前有不同程度的减少，表明我们所采用的脱细胞方法在有效去除细胞和脂质的同时，对细胞外基质的成分有一定的损耗，但胶原蛋白和GAG含量的减少是否会对DAT的生物学活性产生比较大的影响，仍需在进一步的实验中进行检测。提取的脂肪细胞外基质能否作为三维打印支架的来源也需要在进一步的实验中进行检测[5]。
实验中可以观察到，将吸脂后得到的脂肪组织(图1A)，经高低渗透压液体反复浸泡振荡及多次冻融循环后，可见脂肪颜色变浅，类糜状，表面有大量脂滴漂浮(图1B)。组织经匀浆离心后可分为3 层，上层为细胞破坏后分离出来的游离脂质，中层为残余的脂肪，底层的白色絮状物为所要提取的物质(图1C)。将全部的白色沉淀收集起来，分别加入到triton X-100、异丙醇和含有DNA酶和RNA酶的高渗氯化钠中振荡，再次离心后，最终得到一种类似胶原的乳白色的软体物质，具有一定的体积及韧性(图1D)。提取组织体积约占脱细胞前脂肪体积的1/10，提示在脂肪组织中，细胞和油脂成分占更大的比重，因而在去除了细胞和脂质成分后，DAT体积有了明显缩小。图2 脂肪和DAT的组织学染色
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