可溶性角蛋白的酶法制备及其应用研究
发布时间：2021-09-23 08:02
角蛋白因其优良的生物相容性和可降解性,在生物医学领域具有潜在的应用价值。由于天然角蛋白分子中含有大量的二硫键使其溶解性较差,制备可溶性好、分子量可控的角蛋白对推进其生物材料领域的应用具有重要意义。目前常用的物理法和化学法仍然存在着条件苛刻、试剂用量大和角蛋白分子片段偏小等问题,使材料性能和应用领域受到诸多限制。酶法制备可溶性角蛋白条件温和,过程相对可控,符合绿色制造的发展方向。我国是羊毛制品生产大国,在毛纺织物的生产过程中产生了大量的羊毛废弃物。本研究旨在通过双酶法,以羊毛为底物制备出大分子可溶性角蛋白,利用静电纺丝和原位还原方法制备出PHBV/角蛋白/AgNPs纳米纤维膜并对其进行表征,初步开展了上述角蛋白基敷料的抑菌性能与促进伤口愈合的应用研究。论文的主要研究内容如下:（1）角蛋白酶的发酵制备。通过单因素和正交实验,对培养基的组分和发酵条件进行优化,得到适宜的产酶条件,其培养基主要成分为蛋白胨14 g·L-1,酵母提取物28g·L-1,甘油30 g·L-1;培养温度37°C,初始pH为8.0。摇瓶发酵产酶最高达到59...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
可溶性角蛋白的生物材料应用Fig.1-1Biomaterialapplicationofsolublekeratin
江南大学硕士学位论文4图1-2角蛋白结构示意及其分子内部或肽类之间作用力[38]Fig.1-2Thestructuraldiagramofkeratinanditsintramolecularforces1.2.3可溶性角蛋白的提取为充分利用羊毛角蛋白资源，亟需研究开发温和高效的处理加工方法。羊毛中存在的二硫键、氢键、盐键等使其拥有优良的稳定性和较低的溶解度，同时给可溶性角蛋白的制备带来了一定的困难。如表1-2所示，目前可溶性角蛋白的提取方法包括化学法、理法和酶法。1.2.3.1化学法（1）酸法在浓度为6M的盐酸溶液中投入剪碎的羊毛，在120℃条件下反应22h，可以将羊毛水解为氨基酸和分子量在0.3-5kDa之间的多肽溶液。虽然酸法水解率偏高、但是该法所制备的角蛋白分子量不可控。（2）碱法用碱溶液处理羊毛后，二硫键断裂，胱氨酸残基发生降解[39]。然而在处理过程中，含硫化学键的分解会产生具有刺激性气味硫化氢气体[40]。碱法降解羊毛的溶解度大，但是生成的蛋白分子量较校对蛋白质主链的破坏、碱性试剂的大量消耗以及需要大量的酸来中和废液是限制碱法制备角蛋白的主要因素。（3）氧化法在氧化剂的作用下，角蛋白中大量的二硫键被氧化为磺酸基团，从而使不溶性角蛋白可溶。李闻欣等[41]利用氧化剂H2O2在碱性条件下制备出平均分子量为2.5kDa的可溶性角蛋白。奚柏君[42]等利用过氧乙酸在碱性条件下制得分子量为在3-4kDa之间的角蛋白溶液。由于强氧化剂彻底破坏肽链结构，制备出的往往是小分子多肽以及氨基酸的混合物，难以应用于生物材料领域。（4）还原法与氧化法的原理不同，还原法是将二硫键还原为巯基以减小分子间的交联程度，从而获得可溶性角蛋白。如采用巯基化合物等还原剂，可以拆开分子间的二硫键获得具有一定溶解性的角蛋白。为了提高溶解率，通常会加入尿素以?
椭讣字械?天然角蛋白的产酶菌种主要集中于链霉菌属[72-74]。此外，在自然环境中，也存在少数具有角蛋白分解能力的真菌，其分布主要取决于所在环境是否有角蛋白的存在[75]。产角蛋白酶真菌的研究主要集中于皮肤病真菌如毛癣菌和微孢子虫对角蛋白的溶解潜力，这对医学和兽医学领域具有重要意义[75,76]。在非皮肤病菌真菌中，具有良好应用特性的真菌有曲霉属、拟青霉属、帚霉菌属和白僵菌属等。1.3.2角蛋白酶的作用机制目前角蛋白酶普遍被认同的作用机制为复合酶解理论，该降解机理可分为两个主要步骤：变性作用和水解作用（图1-3）。第一步是变性作用：角蛋白酶的二硫键还原酶攻击角蛋白的二硫键，将胱氨酸（-S-S-）还原为半胱氨酸（-SH），同时释放出巯基，角蛋白高级结构遭到破坏解体而形成变性角蛋白[77]；第二步是水解作用：经过变性作用，角蛋白解体为变性角蛋白，变性角蛋白在多肽酶的催化作用下，逐渐被水解成多肽、寡肽和游离氨基酸[78-79]。图1-3角蛋白酶的降解机理Fig.1-3Thecatalyticmechanismofkeratinase1.3.3角蛋白酶的发酵制备如需真正推动角蛋白酶的商业应用，就必须实现其工业化生产，因此研究角蛋白酶的发酵条件十分重要。微生物发酵产角蛋白酶的方法主要包含两种，一是固体发酵，二是液体深层发酵。在已有的研究中，绝大部分细菌都是使用液体深层发酵进行培养来获得酶蛋白的。研究者主要对培养基成分和培养条件这两个方面进行研究，探究这两个因素对酶活的影响从而达到提高酶活的目的。发酵产酶优化一般是采用正交实验、响应面法等数学建模方法对产酶发酵各因素对酶活的影响进行分析，从而达到优化目的。Ramnani[80]等利用响应面方法优化地衣芽孢杆菌RG1的产酶条件，筛选出3个影响菌体产酶量的显著因素，并利用方差分析?
【参考文献】：
期刊论文
[1]静电纺复合空气过滤材料的制备及其性能[J]. 刘超,代子荐,柯勤飞. 东华大学学报(自然科学版). 2019(04)
[2]新型护理敷料在压疮感染性伤口中的应用[J]. 张金萍,姜连英,黄燕,李慧芬,周文华. 长春中医药大学学报. 2015(03)
[3]生物敷料的研究进展[J]. 张劲峰,郝建波,张劲鹏,罗波,刘鹏. 中国修复重建外科杂志. 2015(02)
[4]羊毛角蛋白的还原法溶解及其交联[J]. 于小娟,田俊莹,王江波. 毛纺科技. 2012(03)
[5]还原法与金属盐法结合溶解废旧羊毛[J]. 曾春慧,齐鲁. 纺织学报. 2011(11)
[6]巯基乙醇还原法提取羊毛角蛋白(英文)[J]. 刘让同,徐博,刘欣,王训该. 西安工程大学学报. 2009(02)
[7]离子液体对蛋白酶处理羊毛染色性能的影响[J]. 袁久刚,范雪荣,王强. 天津工业大学学报. 2008(05)
[8]角蛋白水解液在复鞣工序中的应用研究[J]. 李闻欣,谷永鹏,朱连辈,田大伟. 皮革化工. 2005(04)
[9]羊毛角蛋白质溶液的制备[J]. 姚金波,何天虹. 毛纺科技. 2003(04)
[10]微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究[J]. 唐传核,杨晓泉,彭志英,陈中. 食品科学. 2002(03)
硕士论文
[1]基于微生物的纳米材料制备及其应用研究[D]. 戚文秀.东南大学 2016
[2]谷氨酰胺转氨酶对牦牛乳曲拉酪蛋白交联作用的研究[D]. 史莹.甘肃农业大学 2014
[3]羊毛角蛋白/聚乙烯醇纳米纤维膜的制备与表征[D]. 李帅.苏州大学 2014
[4]羽毛角蛋白的高效提取及其在可控释放材料中的应用[D]. 李芳莹.西北师范大学 2010
[5]再生蛋白纤维的研制及性能分析[D]. 奚柏君.苏州大学 2003
[6]角蛋白废物微生物水解技术的研究[D]. 谭盈盈.浙江大学 2003
本文编号：3405343
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
可溶性角蛋白的生物材料应用Fig.1-1Biomaterialapplicationofsolublekeratin
江南大学硕士学位论文4图1-2角蛋白结构示意及其分子内部或肽类之间作用力[38]Fig.1-2Thestructuraldiagramofkeratinanditsintramolecularforces1.2.3可溶性角蛋白的提取为充分利用羊毛角蛋白资源，亟需研究开发温和高效的处理加工方法。羊毛中存在的二硫键、氢键、盐键等使其拥有优良的稳定性和较低的溶解度，同时给可溶性角蛋白的制备带来了一定的困难。如表1-2所示，目前可溶性角蛋白的提取方法包括化学法、理法和酶法。1.2.3.1化学法（1）酸法在浓度为6M的盐酸溶液中投入剪碎的羊毛，在120℃条件下反应22h，可以将羊毛水解为氨基酸和分子量在0.3-5kDa之间的多肽溶液。虽然酸法水解率偏高、但是该法所制备的角蛋白分子量不可控。（2）碱法用碱溶液处理羊毛后，二硫键断裂，胱氨酸残基发生降解[39]。然而在处理过程中，含硫化学键的分解会产生具有刺激性气味硫化氢气体[40]。碱法降解羊毛的溶解度大，但是生成的蛋白分子量较校对蛋白质主链的破坏、碱性试剂的大量消耗以及需要大量的酸来中和废液是限制碱法制备角蛋白的主要因素。（3）氧化法在氧化剂的作用下，角蛋白中大量的二硫键被氧化为磺酸基团，从而使不溶性角蛋白可溶。李闻欣等[41]利用氧化剂H2O2在碱性条件下制备出平均分子量为2.5kDa的可溶性角蛋白。奚柏君[42]等利用过氧乙酸在碱性条件下制得分子量为在3-4kDa之间的角蛋白溶液。由于强氧化剂彻底破坏肽链结构，制备出的往往是小分子多肽以及氨基酸的混合物，难以应用于生物材料领域。（4）还原法与氧化法的原理不同，还原法是将二硫键还原为巯基以减小分子间的交联程度，从而获得可溶性角蛋白。如采用巯基化合物等还原剂，可以拆开分子间的二硫键获得具有一定溶解性的角蛋白。为了提高溶解率，通常会加入尿素以?
椭讣字械?天然角蛋白的产酶菌种主要集中于链霉菌属[72-74]。此外，在自然环境中，也存在少数具有角蛋白分解能力的真菌，其分布主要取决于所在环境是否有角蛋白的存在[75]。产角蛋白酶真菌的研究主要集中于皮肤病真菌如毛癣菌和微孢子虫对角蛋白的溶解潜力，这对医学和兽医学领域具有重要意义[75,76]。在非皮肤病菌真菌中，具有良好应用特性的真菌有曲霉属、拟青霉属、帚霉菌属和白僵菌属等。1.3.2角蛋白酶的作用机制目前角蛋白酶普遍被认同的作用机制为复合酶解理论，该降解机理可分为两个主要步骤：变性作用和水解作用（图1-3）。第一步是变性作用：角蛋白酶的二硫键还原酶攻击角蛋白的二硫键，将胱氨酸（-S-S-）还原为半胱氨酸（-SH），同时释放出巯基，角蛋白高级结构遭到破坏解体而形成变性角蛋白[77]；第二步是水解作用：经过变性作用，角蛋白解体为变性角蛋白，变性角蛋白在多肽酶的催化作用下，逐渐被水解成多肽、寡肽和游离氨基酸[78-79]。图1-3角蛋白酶的降解机理Fig.1-3Thecatalyticmechanismofkeratinase1.3.3角蛋白酶的发酵制备如需真正推动角蛋白酶的商业应用，就必须实现其工业化生产，因此研究角蛋白酶的发酵条件十分重要。微生物发酵产角蛋白酶的方法主要包含两种，一是固体发酵，二是液体深层发酵。在已有的研究中，绝大部分细菌都是使用液体深层发酵进行培养来获得酶蛋白的。研究者主要对培养基成分和培养条件这两个方面进行研究，探究这两个因素对酶活的影响从而达到提高酶活的目的。发酵产酶优化一般是采用正交实验、响应面法等数学建模方法对产酶发酵各因素对酶活的影响进行分析，从而达到优化目的。Ramnani[80]等利用响应面方法优化地衣芽孢杆菌RG1的产酶条件，筛选出3个影响菌体产酶量的显著因素，并利用方差分析?
【参考文献】：
期刊论文
[1]静电纺复合空气过滤材料的制备及其性能[J]. 刘超,代子荐,柯勤飞. 东华大学学报(自然科学版). 2019(04)
[2]新型护理敷料在压疮感染性伤口中的应用[J]. 张金萍,姜连英,黄燕,李慧芬,周文华. 长春中医药大学学报. 2015(03)
[3]生物敷料的研究进展[J]. 张劲峰,郝建波,张劲鹏,罗波,刘鹏. 中国修复重建外科杂志. 2015(02)
[4]羊毛角蛋白的还原法溶解及其交联[J]. 于小娟,田俊莹,王江波. 毛纺科技. 2012(03)
[5]还原法与金属盐法结合溶解废旧羊毛[J]. 曾春慧,齐鲁. 纺织学报. 2011(11)
[6]巯基乙醇还原法提取羊毛角蛋白(英文)[J]. 刘让同,徐博,刘欣,王训该. 西安工程大学学报. 2009(02)
[7]离子液体对蛋白酶处理羊毛染色性能的影响[J]. 袁久刚,范雪荣,王强. 天津工业大学学报. 2008(05)
[8]角蛋白水解液在复鞣工序中的应用研究[J]. 李闻欣,谷永鹏,朱连辈,田大伟. 皮革化工. 2005(04)
[9]羊毛角蛋白质溶液的制备[J]. 姚金波,何天虹. 毛纺科技. 2003(04)
[10]微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究[J]. 唐传核,杨晓泉,彭志英,陈中. 食品科学. 2002(03)
硕士论文
[1]基于微生物的纳米材料制备及其应用研究[D]. 戚文秀.东南大学 2016
[2]谷氨酰胺转氨酶对牦牛乳曲拉酪蛋白交联作用的研究[D]. 史莹.甘肃农业大学 2014
[3]羊毛角蛋白/聚乙烯醇纳米纤维膜的制备与表征[D]. 李帅.苏州大学 2014
[4]羽毛角蛋白的高效提取及其在可控释放材料中的应用[D]. 李芳莹.西北师范大学 2010
[5]再生蛋白纤维的研制及性能分析[D]. 奚柏君.苏州大学 2003
[6]角蛋白废物微生物水解技术的研究[D]. 谭盈盈.浙江大学 2003
本文编号：3405343
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/swyx/3405343.html
