胶原基双层支架用于皮肤创面修复及附属器官再生的研究

发布时间：2017-10-15 20:41

  本文关键词：胶原基双层支架用于皮肤创面修复及附属器官再生的研究

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【摘要】：胶原是细胞外基质的重要组成部分,胶原分子中包含有促细胞黏附和生长的RGD多肽片段,表现出良好的细胞相容性,在组织工程皮肤领域具有广泛应用。本文旨在以胶原为基本材料,以牛跟腱为原料利用乙酸和胃蛋白酶结合抽提的方法,改进胶原的提纯工艺。实验结果表明,当反应温度为4℃,乙酸溶胀时间为24h,胃蛋白酶浓度为0.1%,盐析浓度为2.6M,盐析时间为12h,最终胶原的纯度在98%以上。通过红外光谱,紫外光谱及氨基酸自动分析仪将所提取的蛋白质定性为胶原；通过SDS-PAGE凝胶电泳测试出所提取的胶原蛋白分子量大于300k Da,且纯度高。通过透射电子显微镜观察到了胶原在溶液中的纤维状形态。热学性能检测出了胶原的热变性温度在65℃左右。胶原的重金属元素以及总糖含量都符合国家标准。在此基础上,以自提胶原和壳聚糖为主要原料,采用风干-冷冻冻干的方法,进一步仿生模拟人体皮肤的结构与功能,构建了一种具有双层结构的皮肤再生支架：不对称胶原抗菌双层支架。致密层将包裹抗菌药物磺胺嘧啶银的明胶微球负载在胶原纤维上模拟皮肤的表皮层,起着避免细菌侵入、防止水分蒸发等作用。而多孔层由胶原-壳聚糖三维支架构成,具有良好的孔隙结构,模拟真皮的细胞外基质,以诱导缺损真皮组织再生。胶原不对称抗菌支架具有良好的力学性能,可以控制水蒸气的蒸发,对革兰氏阴性菌和阳性菌均具有明显的抑制作用。磺胺嘧啶银可持续缓释72h,有效避免了直接加药的细胞毒性。体外的成纤维细胞培养证明,胶原不对称抗菌支架具有良好的细胞相容性及细胞活性。为了在表皮和真皮组织修复的同时实现汗腺再生,构建了可表达表皮生长因子(EGF)和外环蛋白(EDA)的功能质粒pDNA-EGF和pDNA-EDA,实现对目的蛋白EGF和EDA的持续表达。以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,制备负载BMSCs的基因活性胶原-壳聚糖支架材料。以负载BMSC的空白支架和pDNA-EGF的硅胶膜/胶原壳聚糖双层支架(BDE)为对照组,将负载pDNA-EGF,pDNA-EDA及pDNA-EGF/EDA/MSC的实验组BDEs植入SD大鼠的脚掌全层皮肤损伤模型中。对2W、4W和8W的组织切片HE染色分析发现,在8W时实验组中发现了类似线圈形状的单管状汗腺结构。为鉴定再生类汗腺结构,对再生组织进行免疫组化(IHC)分析发现,再生类汗腺结构呈现CEA、CK8和CK14阳性,表明再生类汗腺结构具有汗腺特征。对其进行实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹(Western Blotting)测试,相对于对照组,实验组的CEA、CK8和CK14因子蛋白及基因水平的表达都较高。
【关键词】：胶原 双层皮肤支架 抗菌 EGF EDA 基因活性 附属器官
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ427.26;R641
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstracts7-12
• 第一章 引言12-33
• 1.1 皮肤组织工程12-20
• 1.1.1 皮肤的结构与功能12-13
• 1.1.2 皮肤修复过程13-14
• 1.1.2.1 止血期14
• 1.1.2.2 炎症期14
• 1.1.2.3 增殖期14
• 1.1.2.4 重塑期14
• 1.1.3 皮肤替代物14-18
• 1.1.3.1 创面敷料15
• 1.1.3.2 人工皮肤15
• 1.1.3.3 组织工程皮肤15-18
• 1.1.4 皮肤组织工程常用生物材料18-20
• 1.1.4.1 胶原18-19
• 1.1.4.2 明胶19
• 1.1.4.3 壳聚糖19
• 1.1.4.4 纤维蛋白19-20
• 1.1.4.5 其它材料20
• 1.2 皮肤附属器官再生20-27
• 1.2.1 皮肤附属器官介绍20
• 1.2.2 汗腺介绍20-21
• 1.2.3 汗腺再生相关细胞21-22
• 1.2.4 汗腺再生相关生长因子22-23
• 1.2.5 汗腺再生的材料体系设计23-27
• 1.2.5.1 薄膜23-25
• 1.2.5.2 微球25
• 1.2.5.3 水凝胶25-26
• 1.2.5.4 支架26-27
• 1.3 基因治疗在创面修复中的应用27-30
• 1.3.1 基因治疗概述27-28
• 1.3.2 基因传递载体28-29
• 1.3.2.1 病毒载体28
• 1.3.2.2 非病毒载体28-29
• 1.3.3 基因活性支架29-30
• 1.4 课题提出30-33
• 第二章 胶原的提纯与性能表征33-45
• 2.1 实验部分34-35
• 2.1.1 实验试剂和原料34-35
• 2.1.2 胶原的提取与提纯工艺35
• 2.2 胶原的理化性能表征35-38
• 2.2.1 红外光谱测试35
• 2.2.2 紫外光谱测试35-36
• 2.2.3 氨基酸含量分析(纯度)36
• 2.2.4 羟脯氨酸含量分析36
• 2.2.5 透射电子显微镜观察36
• 2.2.6 分子量测定36-37
• 2.2.7 热稳定性分析37
• 2.2.8 总糖含量测定37-38
• 2.2.9 微量元素分析38
• 2.2.10 统计学分析38
• 2.3 结果与讨论38-44
• 2.3.1 红外光谱测试38-39
• 2.3.2 紫外光谱测试39-40
• 2.3.3 氨基酸含量分析(纯度)40
• 2.3.4 羟脯氨酸含量分析40-41
• 2.3.5 透射电子显微镜观察41-42
• 2.3.6 分子量测定42
• 2.3.7 热稳定性分析42-43
• 2.3.8 总糖含量测定43-44
• 2.3.9 胶原的重金属元素含量测定44
• 2.6 本章小结44-45
• 第三章 胶原不对称抗菌双层支架的制备及性能研究45-61
• 3.1 实验部分45-50
• 3.1.1 实验原料和试剂45-46
• 3.1.2 AgSD-明胶微球的制备46
• 3.1.3 AgSD-明胶微球的表征46-47
• 3.1.3.1 AgSD-明胶微球的表面形态及粒径46-47
• 3.1.3.2 AgSD-明胶微球载药量和包封率的测定47
• 3.1.3.3 AgSD-明胶微球的体外释药性能47
• 3.1.4 包裹明胶微球胶原双层支架的制备47-48
• 3.1.5 胶原不对称抗菌双层支架的形貌表征48
• 3.1.6 胶原不对称抗菌双层支架的物理性能48
• 3.1.6.1 胶原不对称抗菌双层支架的力学性能48
• 3.1.6.2 胶原不对称抗菌双层支架的透湿性能48
• 3.1.6.3 胶原不对称抗菌双层支架的吸水率测定48
• 3.1.7 抑菌圈实验48-49
• 3.1.8 胶原不对称抗菌双层支架的生物相容性评价49-50
• 3.1.8.1 材料及仪器的灭菌处理49
• 3.1.8.2 不同载药量胶原抗菌双层支架的细胞毒性评价49
• 3.1.8.3 胶原抗菌双层支架的细胞相容性评价49-50
• 3.1.9 统计学分析50
• 3.2 结果与讨论50-59
• 3.2.1 空白和载药明胶微球的形貌表征50-51
• 3.2.2 AgSD-明胶微球载药量和包封率的测定51
• 3.2.3 AgSD-明胶微球的体外释药性能51-53
• 3.2.5 胶原不对称抗菌双层支架的物理性能53-56
• 3.2.5.1 胶原不对称抗菌双层支架的力学性能53-54
• 3.2.5.2 胶原不对称抗菌双层支架的透湿性能54-55
• 3.2.5.3 胶原不对称抗菌双层支架的吸水率测定55-56
• 3.2.6 抑菌圈实验56-57
• 3.2.7 胶原不对称抗菌双层支架的生物相容性评价57-59
• 3.2.7.1 不同载药量胶原抗菌双层支架的细胞毒性评价57-58
• 3.2.7.2 胶原抗菌双层支架的细胞相容性评价58-59
• 3.2.7.3 胞形态59
• 3.3 本章小结59-61
• 第四章 基因活性胶原基双层支架诱导汗腺再生的体内评价实验61-80
• 4.1 实验部分62-70
• 4.1.1 实验原料和试剂62-63
• 4.1.2 胶原壳聚糖支架的制备63-64
• 4.1.3 基因复合纳米粒子的制备64
• 4.1.4 大鼠骨髓间充质干细胞的提取及培养64
• 4.1.5 基因活性胶原双层支架的制备64-65
• 4.1.6 动物实验模型65
• 4.1.7 大体观察与统计结果分析65
• 4.1.8 组织学观察65-66
• 4.1.9 汗腺结构鉴定66
• 4.1.10 再生组织PCR分析66-68
• 4.1.11 再生组织Western Blotting分析68-70
• 4.1.12 统计学分析70
• 4.2 结果与讨论70-78
• 4.2.1 胶原基因活性支架形貌表征70-71
• 4.2.2 负载细胞的胶原基因活性支架分析71
• 4.2.3 动物实验模型71-72
• 4.2.4 伤口修复大体观察72-73
• 4.2.5 再生汗腺组织学HE染色73-74
• 4.2.6 再生汗腺组织免疫组化分析74-76
• 4.2.7 再生汗腺组织Western Blotting分析76-78
• 4.3 本章小结78-80
• 全文结论80-81
• 不足与展望81-82
• 参考文献82-90
• 作者简介90

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