外周血间充质干细胞移植大鼠脊髓损伤的体内分化与神经功能结构保护作用研究
本文关键词：外周血间充质干细胞移植大鼠脊髓损伤的体内分化与神经功能结构保护作用研究
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【摘要】：目的:研究外周血来源间充质干细胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PB-MSCs)原位移植大鼠脊髓损伤后的体内分化及其对神经功能结构的保护作用,以评价PB-MSCs作为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)替代资源用于治疗脊髓损伤的应用价值。方法:1取8周龄健康SD大鼠,按每日100μg/kg剂量1次腹腔注射粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)连续动员5天,之后取外周血约5~8 ml,密度梯度离心法分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PB-MNCs),采用贴壁培养法得到成纤维样集落生长细胞,取P2代应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)和免疫细胞化学染色法(immunocytochemistry staining,IC)鉴定其表型。2取P2代PB-MSCs经PKH26荧光染料标记后继续培养至P3代移植备用。3健康成年SD大鼠66只,撞击法制备大鼠脊髓损伤动物模型,制模后随机分为模型组(N=15)、PB-MSCs移植组(N=21)和PBS组(N=15)。PB-MSCs移植组在制模成功30 min后用微量注射器将10μl PB-MSCs悬液(2×104个/μl)缓慢注入到距脊髓损伤区头、尾侧各1.0 mm,距中线0.5 mm脊髓实质内,PBS组注射等量PBS作为对照。另取15只SD大鼠仅咬除椎板,不损伤脊髓作为假手术组。4术后所有大鼠每周采用Basso,Beattie,Bresnaham(BBB)行为功能评定表和Ravlin斜板实验对大鼠进行行为及肢体运动功能检查,评定损伤后大鼠运动功能的变化情况。5术后2周、4周、8周取损伤区脊髓组织石蜡切片HE染色观察组织病理学变化;免疫组织化学染色法观察脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神经丝蛋白-200(neurofilament-200,NF-200)和微管相关蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)的表达,用以研究神经胶质瘢痕形成、髓鞘保护及轴突再生情况。6PB-MSCs移植组应用免疫荧光技术检测PKH26阳性的PB-MSCs在损伤段脊髓组织的定植、存活,并用双荧光技术分别检测PKH26+GFAP+、PKH26+MBP+和PKH26+Neu N+双阳性细胞,以研究PB-MSCs向神经胶质细胞、少突胶质细胞及神经元细胞的分化情况。结果:1PB-MNCs原代培养至9天可见明显的成纤维样细胞的集落样生长,培养至18天左右细胞生长汇合度可达80%;传代细胞贴壁能力强,形态均一,呈梭形漩涡状生长。2FCM和免疫细胞化学染色结果表明,富集的PB-MSCs高表达CD90、CD44、CD29、CD73及CD105,不表达CD45、CD11b、CD79a、CD34和HLA-DR。3术后1w及2w模型组、PBS组和PB-MSCs移植组斜板试验及BBB评分三组间差异无统计学意义(P㧐0.05),第3w起,PB-MSCs移植组斜板试验和BBB评分结果明显高于同期模型组和PBS组(P㩳0.01),模型组和PBS组之间无统计学差异(P㧐0.05)。4HE染色结果显示模型组、PBS组和PB-MSCs移植组术后2 w脊髓组织损伤区灰白质界限不清,神经纤维排列紊乱、坏死空洞形成,可见增生的神经胶质细胞;术后4 w坏死空洞较前小且少,模型组、PBS组神经胶质细胞明显增生,PB-MSCs移植组增生不明显;术后8 w模型组、PBS组神经胶质细胞明显增生并聚集形成胶质瘢痕,PB-MSCs移植组神经胶质细胞增生较前变化不大,未见胶质瘢痕形成。5免疫组化结果显示PB-MSCs移植组GFAP表达低于模型组和PBS组(P㩳0.01);MBP、NF-200、MAP-2阳性表达PB-MSCs移植组高于模型组和PBS组(P㩳0.01)。6PB-MSCs移植组脊髓组织冰冻切片可观察到移植治疗后2 w、4 w及8 w时损伤区均有PB-MSCs存活,并见PKH26+GFAP+、PKH26+MBP+及PKH26+Neu N+双荧光阳性细胞。结论:PB-MSCs移植可明显改善SCI大鼠后肢运动功能的恢复;原位移植的PB-MSCs在大鼠体内能定植、存活至少8周,并可向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化;同时,PB-MSCs移植可降低胶质瘢痕的形成,保护髓鞘,促进神经元轴突的再生。上述结果为PB-MSCs移植治疗SCI提供了临床前实验研究证据,PB-MSCs有望成为治疗SCI的理想MSCs替代资源。
【关键词】：脊髓损伤 细胞移植 外周血 间充质干细胞 大鼠
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2
【目录】：
- 中英文缩略词对照表4-6
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-11
- 前言11-13
- 1.材料与方法13-22
- 2.结果22-35
- 3.讨论35-37
- 4.结论37-38
- 参考文献38-43
- 综述 脊髓损伤治疗研究进展43-49
- 参考文献47-49
- 致谢49-50
- 作者简介50
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8 郑颖t，
本文编号：1049417
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