慢病毒介导的MMP-3shRNA转染对人退变髓核细胞的生物学效应

发布时间：2017-10-18 01:15

  本文关键词：慢病毒介导的MMP-3shRNA转染对人退变髓核细胞的生物学效应

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【摘要】：目的:体外筛选设计并合成的抑制效率最佳的MMP-3shRNA慢病毒载体,并观察其对人退变髓核细胞的生物学效应。方法:采用酶序贯消化法对临床腰椎间盘突出症患者需行摘除术来源的髓核组织进行分离、单层原代细胞培养,应用细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法等方法对髓核细胞进行鉴定;根据人MMP-3基因m RNA序列设计合成4对不同的MMP-3sh RNA序列,与酶切后LV3载体链接并转入感受态细胞,通过PCR和基因测序对扩增的阳性克隆进行鉴定,对慢病毒进行包装和滴度测定;通过荧光定量PCR、Western Blot分别检测转染人退变髓核细胞后MMP-3、Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因和蛋白质水平的变化,从而筛选最佳抑制序列慢病毒载体及其对人退变髓核细胞的生物学效应。结果:原代髓核细胞呈三角形、多角形或短梭形等不规则形状,细胞核较大,培养约3周时,原代髓核细胞汇合可达80%以上;苏木精-伊红染色细胞核呈蓝色,胞浆呈淡红色,甲苯胺蓝染色胞核成深蓝色,胞浆呈淡蓝色,细胞免疫组化及细胞免疫荧光Ⅱ型胶原分别呈黄褐色和绿色荧光。经酶切鉴定阳性扩增片段正确,基因测序显示与设计序列完全相符,滴度检测显示大于1x108TU/ml。MMP3sh RNA慢病毒转染72和96小时后从MMP-3基因和蛋白水平综合筛选得出MMP-3sh RNA3为最佳抑制序列(P0.05)。MMP-3sh RNA3转染人退变髓核细胞5天后检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖m RNA及蛋白水平均增加(P0.01)。结论:成功构建并筛选出抑制效率最佳的MMP-3sh RNA慢病毒载体;慢病毒介导的RNAi可以显著抑制人退变髓核细胞MMP-3的表达,从而增加人退变髓核细胞外基质表达量,有望成为阻止或逆转椎间盘退变的进程而治疗椎间盘退变。
【关键词】：慢病毒 MMP-3 椎间盘退变 RNA干扰 基因治疗
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.5
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 实验材料9-12
• 1.1 主要试剂9-10
• 1.2 主要仪器10
• 1.3 主要试剂配制10-11
• 1.4 组织来源11-12
• 第2章 实验方法12-21
• 2.1 人退变髓核细胞的原代培养、传代、冻存、复苏及鉴定12-15
• 2.1.1 人退变髓核细胞的原代单层培养12
• 2.1.2 人退变髓核细胞的消化传代12
• 2.1.3 人退变髓核细胞的冻存及复苏12-13
• 2.1.4 人退变髓核细胞的鉴定13-15
• 2.2 MMP-3sh RNA慢病毒载体构建15-16
• 2.3 MMP-3sh RNA慢病载体在人退变髓核中的筛选16-19
• 2.3.1 慢病毒侵染效率评价16-17
• 2.3.2 MMP-3sh RNA慢病毒载体的侵染17
• 2.3.3 Real-Time PCR检测目的基因m RNA水平17-18
• 2.3.4 Real-Time PCR检测MMP-3 基因不同时间点的表达18
• 2.3.5 Western-Blot检测目的蛋白表达水平18-19
• 2.3.6 Western-Blot检测MMP-3 蛋白不同时间点的表达水平19
• 2.4 最佳干扰片段MMP-3sh RNA慢病毒载体侵染人退变髓核细胞的生物学效应19-20
• 2.4.1 最佳干扰片段MMP-3sh RNA慢病毒载体侵染人退变髓核细胞19-20
• 2.4.2 Real-Time PCR检测MMP-3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达水平20
• 2.4.3 Western-Blot检测MMP-3、Ⅱ型胶原和蛋白多糖蛋白表达水平20
• 2.5 统计学方法20-21
• 第3章 实验结果21-36
• 3.1 人退变髓核细胞培养及鉴定结果21-24
• 3.1.1 人退变髓核细胞形态学观察21-22
• 3.1.2 人退变髓核细胞的鉴定22-24
• 3.2 MMP-3sh RNA载体构建及慢病毒包装结果24-26
• 3.2.1 PCR鉴定构建的慢病毒载体结果24
• 3.2.2 基因测序结果24-25
• 3.2.3 病毒滴度测定25-26
• 3.3 MMP-3sh RNA慢病毒载体在人退变髓核细胞中筛选结果26-31
• 3.3.1 慢病毒侵染人退变髓核细胞的效率评价及MOI计算26-27
• 3.3.2 重组MMP-3sh RNA慢病毒载体对人退变髓核细胞的侵染结果27-28
• 3.3.3 MMP-3sh RNA转染人退变髓核细胞后MMP-3m RNA表达抑制水平28-30
• 3.3.4 MMP-3sh RNA转染人退变髓核细胞后MMP-3 蛋白表达抑制水平30-31
• 3.4 MMP3-sh RNA3(6076)转染人退变髓核细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的效应31-36
• 3.4.1 MMP-3m RNA和MMP-3 蛋白的干扰效果检测31-33
• 3.4.2 Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖m RNA表达情况33-34
• 3.4.3 Western Blot检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖蛋白表达34-36
• 讨论36-40
• 结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述：腰椎间盘退变基因治疗研究进展45-60
• 综述参考文献55-60
• 攻读学位期间的研究成果60-61
• 附录61-63
• 致谢63-64

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