PPARγ基因干扰腺病毒载体重组及鉴定

发布时间：2017-10-18 14:09

  本文关键词：PPARγ基因干扰腺病毒载体重组及鉴定

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【摘要】：目的:构建PPARγ基因干扰腺病毒载体,为PPARγ基因在创伤性脑损伤中的功能研究及分子机制阐述奠定基础。方法:针对人源PPARγ基因设计4条siRNA,采用脂质体转染方法导入LN229细胞中,利用RT-PCR技术检测基因干扰效果,确定一条干扰效果最好的siRNA链用人工合成方式合成两端带Sfi酶切位点的shRNA,用Sfi酶切pAd-pSES-HUS质粒,用T4连接酶将shRNA连接到pAd-PSES-HUS质粒中,用Pmel和EcoRV双酶切重组质粒验证,将正确克隆的穿梭质粒用Pmel线性化后转到BJ5183与骨架质粒pAdeasy1同源重组成腺病毒质粒。Pacl酶切验证,将正确重组的质粒转入HEK293细胞中包装腺病毒,提取病毒颗粒测定滴度并感染LN229细胞,采用RT-PCR和Western-blot验证重组病毒干扰功能。结果:(1)成功构建pAd-pSES-HUS-PPARγ-shRNA穿梭质粒。(2)得到正确同源重组的腺病毒质粒。(3)成功制备具有干扰PPARγ基因的腺病毒颗粒。结论:本实验中成功构建具备干扰PPARγ基因的腺病毒颗粒,为PPARγ基因在炎症反应中功能研究奠定基础。
【关键词】：PPARγ 腺病毒 干扰 脑损伤 炎症反应
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15;Q78
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-13
• 1 材料13-16
• 1.1 主要试剂13-14
• 1.2 主要仪器14-15
• 1.3 重要试剂配制15-16
• 1.4 实验对象16
• 2 方法16-26
• 2.1 PPARγ 基因siRNA设计及合成16
• 2.2 LN229细胞复苏培养与冻存16-17
• 2.3 siRNA转染17
• 2.4 mRNA水平检测17-19
• 2.4.1 细胞总RNA提取17-18
• 2.4.2 RT-PCR反应18-19
• 2.5 PSES-HUS-PPARγsiRNA重组质粒构建19-22
• 2.5.1 shRNA合成19
• 2.5.2 DH5α 感受态制备19-20
• 2.5.3 PSES-HUS质粒转化扩增20
• 2.5.4 PSES-HUS质粒提取20
• 2.5.5 PSES-HUS质粒酶切胶回收20-21
• 2.5.6 连接21
• 2.5.7 转化21
• 2.5.8 重组质粒验证21-22
• 2.6 腺病毒质粒同源重组22-23
• 2.6.1 BJ5183感受态制作22
• 2.6.2 穿梭质粒线性化22-23
• 2.6.3 同源重组及鉴定23
• 2.7 腺病毒包装23-24
• 2.8 重组腺病毒鉴定及滴度检测24-26
• 2.8.1 PPARγmRNA水平鉴定24
• 2.8.2 PPARγ 蛋白水平鉴定24-25
• 2.8.3 滴度检测25-26
• 3 结果26-30
• 3.1 PPARγsiRNA鉴定26-27
• 3.2 重组穿梭质粒鉴定27
• 3.3 同源重组质粒鉴定27-28
• 3.4 病毒包装28-29
• 3.5 重组病毒鉴定29-30
• 3.6 滴度测定30
• 讨论30-33
• 结论33-34
• 参考文献34-38
• 文献综述38-47
• 参考文献43-47
• 致谢47-48
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录48

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