胃泌素释放肽受体拮抗剂在小鼠肝缺血再灌注损伤中的保护作用

发布时间：2017-10-27 16:28

  本文关键词：胃泌素释放肽受体拮抗剂在小鼠肝缺血再灌注损伤中的保护作用

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【摘要】：研究目的肝缺血再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)损伤是肝移植,肝切除手术,创伤,失血性休克和心肺复苏等临床常见并发症,严重影响患者的预后。然而,肝I/R损伤的内在分子机制尚未完全明确,目前研究证据表明,当发生肝I/R损伤时,复杂的内在因素,例如活性氧(Reactive oxygen species,ROS),趋化因子和炎性细胞因子,导致中性粒细胞浸润、炎症反应与肝细胞损伤。但目前用于防止肝I/R损伤的治疗策略并不是最优化的。胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)是一种活性神经肽,与其受体胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptor,GRPR)相互作用后可促进细胞生长,参与免疫功能调节等多种生物学功能,已有研究表明GRP-GRPR在脓毒症、胆囊炎等炎症性疾病中发挥重要作用,通过阻断GRP-GRPR反应可以抑制炎症发展,改善免疫功能失常状态。那么,GRP-GRPR在小鼠肝I/R模型中发挥何种作用,阻断GRP与GRPR反应能否改善肝I/R损伤尚未见报道。因此,本研究拟建立部分肝缺血再灌注损伤小鼠模型,观察GRP和GRPR在小鼠肝脏中的表达情况;探索GRPR拮抗剂RC-3095对小鼠肝I/R损伤的保护作用,并探索其可能的作用机制。研究方法1、将C57BL/6小鼠按照再灌注时间随机分为假手术组(sham,n=6)和I/R 3h组(3h,n=6)、I/R 6h组(6h,n=6)、I/R 12h组(12h,n=6)、I/R 24h组(24h,n=6),I/R组小鼠建立70%肝组织I/R损伤模型,缺血时间均为60min;sham组小鼠仅剖腹探查,并不做肝门部血管结扎处理。在缺血60min,再灌注3h,6h,12h和24h不同时间点时,各组小鼠于七氟醚麻醉下心脏穿刺采血,并获取缺血部分肝脏组织,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定小鼠血清和肝组织中GRP的表达水平;蛋白质免疫印记法(Western-blotting,WB)测定肝脏组织中GRPR蛋白的表达水平。2、将C57BL/6小鼠随机分为三组:假手术组(sham,n=6)、I/R组(I/R,n=6)以及RC-3095组(RC-3095,n=6)。缺血60min时,RC-3095组小鼠予以皮下注射RC-3095(3 mg/kg,150μl),sham组及I/R组小鼠皮下注射同等体积生理盐水。注射后进行再灌注,6h后,七氟烷麻醉下心脏穿刺采血处死,并获取各组小鼠缺血部分肝脏组织,(1)生化检测仪测定血清AST、ALT浓度;(2)HE染色后评估肝组织形态学改变;(3)检测肝脏髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,评估肝组织氧化应激和中性粒细胞浸润程度;(4)ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平;(5)采用TUNEL(Td T-mediated d UTP nick end labeling)法检测缺血肝细胞凋亡情况。3、另取32只C57BL/6小鼠,分组情况同2,再灌注时间为6h,12h,24h,七氟烷麻醉下心脏穿刺采血处死小鼠后,肝组织经匀浆、蛋白定量后,WB法检测核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38-MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化水平。结果1、GRP和GRPR表达:肝脏缺血60min,再灌注3h,小鼠肝组织中GRP便升高且达到峰值,持续到再灌注后6h(P0.01),随后逐渐降低,但12h和24h时与sham组仍存在显著差异;血清中,GRP 3h时也显著升高,6h达到峰值(P0.01),随后开始下降,12h和24h时与sham组并无显著差异;肝组织GRPR在再灌注3h时表达上调,6h后也达到峰值(P0.05),随后开始降低,12h和24h表达与Sham组小鼠并无统计学差异。2、RC-3095干预后,与I/R组相比较,RC-3095组小鼠肝损伤改变如下:血清AST、ALT显著降低(P0.01);HE染色显示肝脏细胞肿胀减轻,炎症反应降低,中性粒细胞浸润减少(P0.01);TUNEL染色显示肝细胞凋亡明显减少(P0.01);MPO酶活性显著减弱(P0.01);血清和缺血肝脏组织中TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平下调(P0.01),IL-10无改变,提示RC-3095改善了肝I/R后肝脏的损伤和炎症反应。3、GRP-GRPR参与肝脏I/R损伤的机制探讨显示:RC-3095组小鼠肝脏NF-κB活性比I/R组减弱,并JNK、ERK、p38磷酸化水平降低(P0.01)。结论1、GRP-GRPR在小鼠肝I/R损伤中显著上调;2、GRPR拮抗剂RC-3095显著抑制肝I/R后的炎症反应和肝细胞坏死,从而改善肝损伤;3、GRPR拮抗剂RC-3095抑制小鼠肝I/R损伤后的NF-κB活性,并抑制JNK、ERK、p38-MAPK磷酸化,提示GRP可能通过NF-κB和p38/JNK/ERK通路调节肝I/R损伤的炎症反应。
【关键词】：肝缺血再灌注损伤 胃泌素释放肽 胃泌素释放肽受体 胃泌素释放肽受体拮抗剂
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 缩略词表11-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-28
• 结果28-40
• 讨论40-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-50
• 文献综述 胃泌素释放肽在炎性疾病中的作用50-58
• 参考文献55-58
• 发表论文和参与科研工作情况58-59
• 致谢59-60

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本文编号：1104312