Rho激酶参与氢气保护LPS诱导离体人结肠上皮屏障功能障碍的机制研究

发布时间：2017-10-28 13:14

  本文关键词：Rho激酶参与氢气保护LPS诱导离体人结肠上皮屏障功能障碍的机制研究

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【摘要】：目的脓毒症是感染所致的严重威胁生命的全身炎症反应综合征(SIRS)。脓毒症常继发于创伤、大手术等重大应激事件,可发生于各个年龄段的患者。脓毒症发生率、病死率高,幸存者也常因为并发症和后遗症而导致生活质量严重下降。肠屏障的破坏一直以来被认为是引发脓毒症感染和多器官功能障碍综合征(MODS)的始动因素之一。肠屏障的构成错综复杂,是人体免疫系统的重要组成部分,因此日益成为脓毒症研究的热点和重点。氢气是大气层中自然存在的气体,人体中也有微量的氢以分子形式存在。文献报道,一定浓度的氢气对多种疾病有治疗作用,并已经通过许多模型证实。氢气治疗的具体机制目前还不十分明确。Rho激酶(ROCK)是一种丝/苏氨酸激酶,广泛存在于哺乳动物体细胞内,参与多种细胞生命活动。本研究旨在探究氢气对脓毒症离体人肠上皮细胞屏障功能的影响,以及Rho激酶是否参与了氢气的作用机制。方法人结肠腺癌细胞系Caco-2,培养于无菌含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基,传代培养至对数期用于实验研究。第一部分:用Transwell小室建立Caco-2单层细胞屏障模型,或将细胞接种到96孔板或6孔板中。实验分为6组:对照组(C组)、0.1mg/L细菌脂多糖(LPS)处理组(L1组)、1mg/L LPS处理组(L2组)、10mg/L LPS处理组(L3组)、50mg/L LPS处理组(L4组)、100mg/L LPS处理组(L5组)。处理24h后通过检测跨上皮电阻值(TEER)和FITC-右旋糖酐通过率来观察Caco-2单层细胞屏障完整性和通透性的改变,MTT法检测细胞凋亡情况,Western Blot法检测处理24h后肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。根据结果选择能满足实验需要的LPS处理浓度。第二部分:同第一部分建立细胞模型,实验分为5组:对照组(C组)、富氢培养基组(H组)、细菌脂多糖(LPS)处理组(L组)、富氢培养基+LPS处理组(HL组)、ROCK抑制剂(Y-27632)+LPS处理组(YL组)。对照组与富氢培养基组分别加入等容量DMEM空白高糖培养基和0.6mmol/L富氢培养基。LPS处理浓度为50mg/L,Y-27632处理浓度为25μmol/L。分别于0h、6h、12h、24h四个时间点检测跨上皮细胞电阻值(TEER)和24h FITC-右旋糖酐通过率,MTT法检测处理24h后细胞凋亡水平,Western Blot法检测6h、12h、24h细胞间紧密连接蛋白ZO-1和ROCK蛋白的表达水平,实时聚合酶链式反应(PCR)技术检测处理6h、12h、24h后Caco-2细胞ZO-1 m RNA和ROCK m RNA表达水平,细胞免疫荧光技术检测处理24h后Caco-2细胞ZO-1蛋白分布变化。结果第一部分:与对照组相比,0.1mg/L LPS未能引起跨上皮电阻值和FITC-右旋糖酐通过率的显著改变和Caco-2细胞凋亡水平的显著上升(P0.05),也未能显著降低Caco-2细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达(P0.05);1mg/L和10mg/L浓度的LPS能引起跨上皮电阻值和FITC-右旋糖酐通过率的显著改变(P0.05),并显著增加Caco-2细胞凋亡(P0.05),但未能显著降低Caco-2细胞间紧密连接蛋白ZO-1的表达(P0.05);50mg/L和100mg/L浓度的LPS既能降低跨上皮电阻值,增加FITC-右旋糖酐通过率(P0.05),即破坏了单层细胞屏障的完整性,增加其通透性;也显著增加了Caco-2细胞的凋亡(P0.05),并降低了Caco-2细胞间ZO-1蛋白的表达(均P0.05)。因此本研究选用50mg/L的LPS处理浓度。第二部分:与对照组比较,LPS显著降低了跨上皮电阻,增加了FITC-右旋糖酐通过率,降低了ZO-1 m RNA和蛋白表达,并引起了ROCK m RNA和蛋白的过表达,差异具有统计学意义(P0.05)。LPS引起主要分布于Caco-2细胞间的ZO-1蛋白向细胞内聚集,而细胞膜上的ZO-1蛋白分布减少,分布的连续性被破坏。与LPS处理组比较ROCK抑制剂Y-27632或富氢培养基的加入弱化了LPS对跨上皮电阻值和FITC-右旋糖酐通过率的影响(P0.05);富氢培养基改善了LPS引起的Caco-2细胞凋亡增加的情况(P0.05),ROCK对LPS引起的Caco-2细胞凋亡增加无显著影响(P0.05);ROCK抑制剂或富氢培养基抑制了LPS对ZO-1 m RNA和蛋白的下调,降低了LPS诱导的ROCK m RNA和蛋白过表达,并减弱了ZO-1蛋白从Caco-2细胞膜上向细胞质中再分布的情况,差异具有统计学意义(均P0.05),提示富氢培养基和ROCK抑制剂均能减弱LPS对肠细胞屏障的破坏作用。富氢培养基+LPS处理组中,ROCK m RNA和蛋白表达水平较LPS处理组下降,说明ROCK蛋白可能参与了氢气对肠细胞屏障的保护作用。结论LPS能直接损伤离体肠上皮屏障,氢气能显著缓解LPS对肠上皮屏障的损伤作用。Rho激酶可能参与了氢气对肠屏障的保护效应。
【关键词】：脓毒症 肠屏障 富氢培养基 紧密连接蛋白 Rho 激酶
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-17
• 研究现状及成果14-15
• 研究目的和方法15-17
• 第一部分 不同浓度细菌脂多糖对Caco-2 单层细胞屏障功能的影响17-31
• 1.1 实验材料17-20
• 1.1.1 实验细胞及器材17-18
• 1.1.2 主要试剂18-19
• 1.1.3 主要液体及其配制19-20
• 1.2 实验方法20-26
• 1.2.1 Caco-2 细胞培养20-21
• 1.2.2 富氢培养基的制备21
• 1.2.3 利用Transwell小室建立Caco-2 单层细胞屏障模型21-22
• 1.2.4 分组及处理22-26
• 1.2.5 统计学分析26
• 1.3 结果26-30
• 1.4 小结30-31
• 第二部分 富氢培养基对LPS诱导的Caco-2 单层细胞屏障功能障碍的保护和ROCK在其中的作用31-49
• 2.1 实验材料31-35
• 2.1.1 实验细胞及器材31-32
• 2.1.2 主要试剂32-34
• 2.1.3 主要液体及其配制34-35
• 2.2 实验方法35-40
• 2.2.1 Caco-2 细胞培养35
• 2.2.2 富氢培养基的制备35
• 2.2.3 Caco-2 单层细胞屏障的建立35
• 2.2.4 分组及处理35-39
• 2.2.5 统计学分析39-40
• 2.3 结果40-48
• 2.4 小结48-49
• 讨论49-57
• 结论57-58
• 创新点和局限性58-59
• 参考文献59-67
• 发表论文和参加科研情况说明67-68
• 综述 ROCK与肠上皮屏障的研究及进展68-78
• 综述参考文献73-78
• 致谢78-80
• 个人简历80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Lena Antoni;Sabine Nuding;Jan Wehkamp;Eduard F Stange;;Intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年05期

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本文编号：1108374