早期鸡胚活性粗提物对小鼠组织创伤修复的应用研究

发布时间：2017-11-01 06:14

  本文关键词：早期鸡胚活性粗提物对小鼠组织创伤修复的应用研究

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【摘要】：本试验旨在研究早期鸡胚细胞活性物代替哺乳动物胚胎干细胞在皮肤损伤修复方面的临床应用效果。在试验中对种蛋进行孵化,提取早期鸡胚细胞活性物,制备成药膏应用于动物创伤试验,并通过同源性比对得出鸡与小鼠在创伤修复相关的细胞生长因子的蛋白活性成分上具有高度同源性。本试验意义在于探讨早期鸡胚细胞活性物的临床效果,为其在临床应用上提供新的思路和借鉴。1.早期鸡胚细胞的分离及活性物的提取为了确定最佳孵化时间和条件,本试验采用新鲜种蛋在温度为37℃,湿度为55%的培养箱中孵化,选取0h,24h,48h,72h的入孵蛋采用药勺法分离原代细胞,向提取物滴加瑞氏-吉姆萨染色液。结果显示,孵化72h是最佳分离时间。此期显微镜下可见早期的鸡胚细胞形态较圆,似球形,细胞较小,核较大。为了确定鸡胚活性物的提取方法,本试验将提取的鸡胚原代细胞分别在液氮(-196℃),-80℃,-20℃条件下进行反复冻融3次,并在37℃恒温水浴锅进行融解。结果显示:在液氮、-80℃的条件下观察冻融后的细胞其裂解率为分别为87%和85%,差异不显著,但是相对于-20℃裂解率70%,有显著差异。-80℃对于液氮而言操作简便,所以选取-80℃作为反复冻融条件提取鸡胚活性物以备后续试验用。2.软膏剂基质的确定为了探索O/W型基质软膏的最佳制作配方和工艺,本试验通过对外观性状、耐寒与耐热性试验、离心试验和p H值测定,筛选出适宜的乳化剂,经正交试验确定最佳处方。最佳配方和工艺为硬脂酸10g,白凡士林5g,羊毛脂1.5g,冰片1.0 g,液体石蜡3g为油相,加热至80℃;另称取甘油5g,吐温-80 5g,三乙醇胺0.7g,尼泊金乙酯0.06g,加蒸馏水调节油、水两相至100g,加热至85℃;待其完全溶解后,将油相缓慢加入水相中,不停地搅拌至乳化完全;当基质温度降至40℃左右时,加入10g提取物。最后在制作的活体动物皮肤破损模型上涂抹制备的膏剂进行刺激性试验,结果表明此膏剂对皮肤无刺激性,可以在动物临床实验上进行应用。3.动物创伤模型的建立为了探索早期鸡胚细胞活性物软膏对创伤修复的作用,构建昆明小鼠刀切伤,烫伤和眼部损伤模型,皮肤表面涂抹制备的早期鸡胚细胞活性物软膏以及眼部滴加早期鸡胚细胞活性提取物。结果显示:在烫伤模型中,涂抹软膏剂的伤口愈合比涂抹红霉素软膏组和对照组愈合快。在12d时,涂抹早期鸡胚细胞活性物膏剂组的创面面积为0.62cm2,创面愈合率为60.16%,对照试验组小鼠的创面面积为1.13cm2,创面愈合率为26.50%,差异极显著(p0.01);在刀切伤口组中,涂抹早期鸡胚细胞活性物膏剂组与涂抹红霉素软膏组和空白实验组比较,其伤口愈合快,第7d时,涂抹自制膏剂组伤口长度为1.10cm,红霉素软膏组伤口长度为1.35cm,差异不显著,但对照组伤口为1.58cm,愈合情况差异显著(p0.05);在眼部损伤模型中,滴加早期鸡胚细胞活性物提取液对小鼠眼部损伤具有修复作用,可抑制炎症反应,并且具有促进毛发生长的作用。本试验通过皮下注射、滴眼和皮肤表面涂抹不同的给药方式,探究早期鸡胚细胞活性物对小鼠机体的影响,测量小鼠体温,其体温上下波动均在0.5℃内,小鼠并未出现高热、过敏等免疫排斥现象。因此,早期鸡胚细胞活性物虽是异源物质,与小鼠存在较大的种族差异,但经蛋白序列比对,b FGF同源性高达90%、EGF和SCF为53%、VEGF为78%、IGF为76%、TGF-β为56%、PDGF为80%,其细胞活性成分具有高度同源性,且对于创伤修复有促进作用,可以应用于临床动物试验。
【关键词】：鸡胚干细胞 鸡胚活性物 膏剂 创伤
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R641
【目录】：

• 致谢4-11
• 摘要11-13
• 文献综述13-21
• 1 胚胎干细胞的研究进展13-17
• 1.1 哺乳动物胚胎干细胞研究进展13-14
• 1.2 禽类胚胎干细胞研究进展14-15
• 1.2.1 鸡的胚胎发育特点14-15
• 1.3 胚胎干细胞的生物学特性15-16
• 1.3.1 ES细胞的全能性及多能性15
• 1.3.2 ES细胞的自我更新能力15-16
• 1.4 胚胎干细胞的应用前景16
• 1.4.1 ES细胞在体外诱导分化为特定细胞16
• 1.4.2 ES细胞在药物安全性研究中的应用16
• 1.4.3 ES细胞在移植与细胞替代疗法中的应用16
• 1.5 胚胎干细胞研究面临的困难与挑战16-17
• 1.5.1 ES细胞的建系17
• 1.5.2 胚胎干细胞成瘤性17
• 1.5.3 定向诱导ES细胞分化17
• 1.5.4 移植后的免疫排斥反应17
• 2 创伤修复的研究进展17-19
• 2.1 创伤修复17-18
• 2.2 影响创伤修复的因素18
• 2.2.1 巨噬细胞18
• 2.2.2 血小板18
• 2.2.3 脂肪组织18
• 2.3 临床上常用的创伤修复方法18-19
• 2.3.1 基因工程技术18-19
• 2.3.2 组织工程19
• 2.3.3 中草药19
• 2.3.4 干细胞疗法19
• 2.4 生长因子与创伤修复19
• 3 软膏剂的制备工艺19-20
• 3.1 软膏剂基质的选择19-20
• 3.2 乳化方法的选择20
• 3.3 乳化温度的选择20
• 3.4 软膏剂的初步稳定性试验20
• 4 小结20-21
• 引言21-22
• 试验一 鸡胚活性粗提物的分离提取22-26
• 1 材料与方法22-23
• 1.1 试验材料22
• 1.1.1 试验动物22
• 1.1.2 主要试剂22
• 1.1.3 主要仪器设备22
• 1.2 试验方法22-23
• 1.2.1 种蛋的培养22
• 1.2.2 X期鸡胚胚盘细胞的分离与收集22-23
• 1.2.3 早期鸡胚盘细胞的形态学鉴定23
• 1.2.4 早期鸡胚盘细胞活性物的提取23
• 2 结果与分析23-24
• 2.1 不同时期种蛋发育情况23-24
• 2.2 早期鸡胚盘细胞的形态学鉴定24
• 2.2.1 早期鸡胚盘细胞电子显微镜下的鉴定24
• 2.3 不同条件下反复冻融后的鸡胚盘细胞的比较24
• 2.4 早期鸡胚细胞活性物的提取24
• 3 讨论24-26
• 3.1 早期胚胎发育的特点24-25
• 3.1.1 早期胚胎干细胞的迁移24
• 3.1.2 种蛋孵化过程中营养物质的变化24-25
• 3.2 细胞裂解方法的比较分析25
• 3.3 早期鸡胚细胞活性物的释放25-26
• 试验二 早期鸡胚细胞活性物软膏的制备26-32
• 1 材料与方法26-29
• 1.1 实验材料26
• 1.1.1 主要试剂26
• 1.1.2 主要仪器26
• 1.1.3 试验动物26
• 1.2 试验方法26-28
• 1.2.1 基质类型的筛选26-27
• 1.2.2 软膏基质的筛选27
• 1.2.3 软膏基质配方确定27
• 1.2.4 试验方法27
• 1.2.5 试验设计27-28
• 1.3 稳定性试验28
• 1.3.1 外观观察28
• 1.3.2 耐寒与耐热性试验28
• 1.3.3 离心试验28
• 1.3.4 p H值测定28
• 1.4 主药与基质的配比28
• 1.5 刺激性试验28
• 1.6 早期鸡胚细胞活性物软膏剂的抗菌效果28-29
• 2 结果与分析29-30
• 2.1 软膏基质的优选29
• 2.2 基质比例的优选29-30
• 2.3 软膏剂基质配方的确定30
• 2.4 药物与基质比例的优选30
• 2.5 制备过程30
• 2.6 鸡胚活性物软膏剂的形态学观察30
• 2.7 刺激性试验结果分析30
• 2.8 软膏剂抗菌效果研究30
• 3 讨论30-32
• 3.1 软膏剂的制备工艺30-31
• 3.2 透皮促进剂的作用31
• 3.3 工艺流程图31-32
• 试验三 软膏剂对小鼠组织创伤的修复作用32-40
• 1 试验材料与方法32-33
• 1.1 试验材料32
• 1.1.1 试验动物32
• 1.1.2 试剂32
• 1.1.3 主要仪器32
• 1.2 同源性分析32
• 1.3 试验前准备32-33
• 1.3.1 试验动物的分组32
• 1.3.2 麻醉药的使用32-33
• 2 实验方法33-34
• 2.1 小鼠烫伤模型的建立33
• 2.1.1 小鼠烫伤的治疗33
• 2.2 小鼠刀切伤伤口模型的建立33-34
• 2.2.1 小鼠刀切伤伤口的治疗33-34
• 2.3 小鼠创伤组织病理切片的制作34
• 2.3.1 病理切片的取材与处理34
• 2.3.2 在电子显微镜下观察皮肤病理切片34
• 2.4 小鼠眼部损伤模型的建立34
• 3 结果与分析34-38
• 3.1 同源性分析结果34-35
• 3.2 烫伤组实验小鼠的生理状态35-37
• 3.2.1 涂抹鸡胚细胞活性物软膏对烫伤愈合的影响35
• 3.2.2 涂抹红霉素软膏对烫伤愈合的影响35-36
• 3.2.3 对照试验组小鼠烫伤愈合情况36
• 3.2.4 烫伤组愈合时间及创面面积变化36
• 3.2.5 小鼠烫伤组织病理切片的分析36-37
• 3.3 伤口组实验小鼠的生理状态37-38
• 3.3.1 涂抹鸡胚干细胞活性物软膏对伤口的愈合影响37
• 3.3.2 涂抹红霉素软膏对伤口的愈合影响37
• 3.3.3 对照试验组伤口的愈合影响37
• 3.3.4 各处理组伤口愈合情况分析37
• 3.3.5 小鼠伤口创伤组织病理切片的分析37-38
• 3.4 小鼠眼部损伤愈合情况38
• 3.5 不同给药方式下小鼠体温的变化情况38
• 4 结论38-40
• 4.1 鸡胚活性提取物软膏剂的安全性试验38
• 4.2 鸡胚活性提取物软膏剂对创伤修复的影响38-40
• 小结40-41
• 试验附图41-49
• 参考文献49-53
• Abstract53-54

【参考文献】

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本文编号：1125591