京尼平交联兔脱细胞气管支架原位移植的实验研究

发布时间：2017-11-01 07:42

  本文关键词：京尼平交联兔脱细胞气管支架原位移植的实验研究

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【摘要】：先天性畸形、创伤、肿瘤、感染、损伤后长期气管插管和某些自身免疫性疾病,可以导致气管狭窄或坏死,需要气管重建或移植。各种良性或恶性气管病变患者的主要治疗方法为气管切除术。然而,当病变的气管长度达到儿童的30%或成人的50%时,切除病变气管直接端端吻合将带来巨大风险。组织工程是结合工程技术和生物学原理应用于功能性组织替代的一个新兴研究,以促进受损组织再生,有望成为长段气管重建的有效治疗手段。本研究以新西兰兔为对象,通过脱细胞及京尼平交联方法得到气管支架,并种植自体骨髓间充质干细胞,运用生长因子,原位移植气管,综合评估原位移植效果,监测其免疫原性和排斥反应。在此基础上,通过梯度离心法获取自体骨髓单个核细胞,并使用细胞示踪剂绿色荧光蛋白标记自体骨髓单个核细胞。含有绿色荧光蛋白标记的自体骨髓单个核细胞可以在脱细胞气管支架上分化为软骨细胞,这一实验过程避免了干细胞在体外培养,大大缩短了组织工程气管的制备周期,节约了时间和经济成本,为需要组织工程气管移植的患者争取了更多的治疗时间。第一部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓间充质干细胞的体内原位移植研究目的：通过对由京尼平交联的脱细胞气管支架进行原位移植,并在术中种植自体骨髓间充质干细胞进行研究,观察骨髓间充质干细胞在体内分化为软骨细胞的情况,并对上皮细胞再生情况及移植后炎症排斥反应进行评价。方法：1.脱细胞气管支架的制备；2.脱细胞气管支架的体外检测；3.自体骨髓间充质干细胞的培养与鉴定；4.气管原位移植；5.气管原位移植后检测。结果：1.气管脱细胞后,上皮细胞清除完全,软骨细胞大部分被清除,Ⅱ型胶原保留完整：2.通过全骨髓培养贴壁筛选法获取骨髓间充质干细胞,培养至第3代的骨髓间充质干细胞形态规则,具有多项分化潜能；3.脱细胞后京尼平交联的气管支架加骨髓间充质干细胞原位移植后,炎症反应程度与自体原位移植相似,种植的骨髓间充质干细胞在体内可以分化为软骨细胞。结论：1.通过去污剂-联合酶法获取了脱细胞气管支架,运用天然交联剂京尼平交联得到了京尼平交联脱细胞气管支架；2.采用全骨髓贴壁培养法分离纯化了自体骨髓间充质干细胞,利用骨髓间充质干细胞的形态特征及多向分化潜能鉴定了自体骨髓间充质干细胞；3.种植有自体骨髓间充质干细胞的脱细胞气管支架在原位移植实验中取得成功,自体骨髓间充质干细胞在体内分化为软骨细胞,未发生明显的排斥反应。第二部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓单个核细胞的体内原位移植研究目的：通过对含有绿色荧光蛋白示踪剂的骨髓单个核细胞在京尼平交联的脱细胞气管支架原位移植中的研究,观察骨髓单个核细胞内绿色荧光蛋白含量,评估种植的自体骨髓单个核细胞分化为软骨细胞的情况,并对使用生长因子后外周血中单个核细胞含量进行评价,探讨自体骨髓单个核细胞在组织工程气管移植中的作用。方法：1.脱细胞气管支架的制备；2.293T细胞的复苏及培养；3.转染质粒的获取；4.293T细胞的转染；5.自体骨髓单个核细胞的获取；6.慢病毒的获取及细胞的感染；7.气管原位移植；8.气管移植后单个核细胞含量检测及单个核细胞分化为软骨细胞情况的检测。结果：1.293T转染含有绿色荧光蛋白质粒后细胞表达绿色荧光蛋白,并能合成含有绿色荧光蛋白可以感染其他细胞的慢病毒；2.含有绿色荧光蛋白的慢病毒可以感染骨髓单个核细胞,在荧光显微镜下可以看到细胞内有绿色荧光出现；4.种植有含绿色荧光蛋白的自体骨髓单个核细胞的京尼平交联脱细胞气管支架原位移植后,种植的骨髓单个核在体内可以分化为软骨细胞,在分化成的软骨细胞中含有绿色荧光蛋白。结论：1.绿色荧光蛋白可以在293T细胞内被包装在慢病毒内,在不影响其他细胞活性的情况下将绿色荧光蛋白转入其他细胞中；2.通过梯度离心得到的自体骨髓单个核细胞可以被含有绿色荧光蛋白的慢病毒感染,绿色荧光蛋白在不影响骨髓单个核细胞的情况下对其进行标记；3.通过慢病毒感染的方法对自体骨髓单个核细胞进行示踪,鉴定气管移植后再生的软骨细胞由种植的自体骨髓单个核细胞分化而来；4.自体骨髓单个核细胞在原位移植的京尼平交联脱细胞气管支架上可以分化为软骨细胞,这一过程避免了干细胞体外培养过程,节省了时间成本和经济成本。与骨髓间充质干细胞相比,骨髓单个核细胞是更为理想的一种干细胞。
【关键词】：气管 组织工程 京尼平 移植 骨髓单个核细胞 骨髓间充质干细胞
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R653
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 符号说明13-14
• 第一部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓间充质干细胞的体内原位移植研究14-30
• 前言14
• 1 材料和试剂配制14-17
• 1.1 实验动物14-16
• 1.1.1 实验设备14-15
• 1.1.2 试剂耗材15-16
• 1.2 实验用试剂配制16-17
• 2 方法17-22
• 2.1 脱细胞气管支架的制备17-18
• 2.2 脱细胞支架的体外检测18-20
• 2.3 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定20-21
• 2.4 气管原位移植实验21
• 2.5 气管移植后的检测21-22
• 2.6 统计学分析22
• 3 结果22-24
• 3.1 气管支架的细胞含量22
• 3.2 气管支架的组织学结构22-23
• 3.3 气管支架的Ⅱ型胶原含量23
• 3.4 气管支架上皮细胞含量23
• 3.5 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定结果23
• 3.6 动物实验结果23-24
• 3.7 气管移植后外周血成分的变化24
• 3.8 动物实验后气管软骨细胞及上皮细胞再生情况24
• 4 讨论24-28
• 5 参考文献28-30
• 第二部分 京尼平交联脱细胞气管支架种植自体骨髓单个核细胞的体内原位移植研究30-40
• 前言30-31
• 1 材料和试剂配制31-33
• 1.1 材料31-33
• 1.1.1 实验动物31
• 1.1.2 实验设备31
• 1.1.3 试剂耗材31-33
• 1.2 实验用试剂配制33
• 2 方法33-36
• 2.1 脱细胞气管支架的获取33
• 2.2 293T细胞的复苏及培养33-34
• 2.3 含有转染所需质粒的大肠杆菌的培养34
• 2.4 质粒的提取34
• 2.5 293T细胞转染34
• 2.6 单个核细胞获取34-35
• 2.7 慢病毒的获取及细胞的感染35
• 2.8 气管原位移植实验35-36
• 2.9 气管移植后的检测36
• 2.10 统计学分析36
• 3 结果36-37
• 3.1 293T细胞转染的结果36
• 3.2 慢病毒感染细胞的结果36-37
• 3.3 外周血中单个核细胞含量变化37
• 3.4 动物实验后CK-18免疫荧光结果37
• 3.5 动物实验后Ⅱ型胶原免疫荧光结果37
• 3.6 动物实验后单个核细胞生长及分化的结果37
• 4 讨论37-39
• 5 参考文献39-40
• 实验结论40-41
• 附录41-51
• 文献综述51-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 攻读学位期间发表的学术论文59-60

【参考文献】

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1 舒朝锋,崔磊,刘伟,曹谊林;人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究[J];中华创伤骨科杂志;2004年02期

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本文编号：1125887