转化生长因子β1基因修饰骨髓间充质干细胞的实验研究

发布时间：2017-11-19 20:18

  本文关键词：转化生长因子β1基因修饰骨髓间充质干细胞的实验研究

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【摘要】：第一部分比格犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定[目的]建立犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离、培养方法,并对骨髓间充质干细胞进行鉴定,选择增殖分化能力最佳的BMSCs,以期为移植实验提供基础。[方法]无菌条件下行犬髂后上棘穿刺,抽取比格犬骨髓10ml,采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法体外分离、培养和扩增犬BMSCs,并诱导BMSCs向成骨细胞方向分化。倒置相差显微镜观察其形态学变化,绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物。[结果]原代和传代的BMSCs贴壁生长,呈纺锤形、长梭形,漩涡状排列、成集落生长,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。第3代BMSCs表面标志物CD29、CD44分子阳性,CD34分子阴性。成骨方向诱导形成的矿化结节茜素红染色阳性,碱性磷酸酶(ALP)染色阳性。[结论]采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够有效分离和培养犬BMSCs,分离培养的BMSCs具有间充质干细胞标志性表面抗原,能够向成骨细胞诱导分化,为移植实验提供种子细胞。第二部分TGF-β1基因转染BMSCs慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达[目的]通过慢病毒载体系统将目的基因TGF-β1基因包装并转染BMSCs,观察TGF-β1基因在BMSCs内的表达及对其增殖代谢的影响。[方法]利用基因转染技术将TGF-β1基因定向克隆至慢病毒载体,构建TGF-β1基因重组质粒,质粒转化后行PCR、酶切和测序鉴定。在脂质体LP2000的作用下转染293T细胞,以实时荧光QPCR检测慢病毒滴度,以合适MOI感染犬BMSCs。荧光显微镜下观察TGF-β1蛋白表达情况,并以半定量RT-PCR及Western Blot检测感染后犬BMSCs中TGF-β1 mRNA和蛋白表达情况。观察转染后BMSCs细胞增殖代谢能力。[结果]基因转染技术构建TGF-β1重组慢病毒,经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,转染293T细胞能够正确表达,重组慢病毒滴度为1×108TU/ml,慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为10,构建的重组慢病毒感染BMSCS能高效表达TGF-β1基因。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染犬BMSCs并能高效稳定表达。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R617

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本文编号：1204780