神经肽Y对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控效应及其经典Wnt信号通路相关性研究

发布时间：2017-12-18 14:12

  本文关键词：神经肽Y对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化调控效应及其经典Wnt信号通路相关性研究

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【摘要】：骨折及骨不愈合、延迟愈合等是创伤骨科常见疾病,其治疗的方法和相关原理一直是骨科领域内研究的难点和热点问题,如果临床疗效效果不佳则会对患者的预后带来严重的影响。因此为了改善患者的功能预后,探讨骨代谢、骨再生等的生物学机制及其病理生理学特点是基础和前提。对骨折再生和重建过程中多种因素的生物学效应及调控机制进行广泛深入的研究,也将为临床治疗提供了全新治疗思路和技术方法。骨骼感觉神经元能分泌多种神经肽,包括降钙素基因多肽(Calcitonin gene related pept ide, CGRP)、神经肽Y (Neuropeptide Y, NPY)和P物质(substance P,SP)等。以往研究表明,神经肽可通过多种途径影响骨组织形成及代谢,对骨折愈合过程也着有非常重要的作用。在哺乳动物中枢神经系统中分布广泛、含量最高的神经肽之一就是神经肽Y。NPY是一个由三十几种氨基酸脱水缩合而成的化合物,具有多样生理功能,其中NPY经典的生理作用主要是调节心血管活动以及调控摄食行为等。神经肽Y受体属于G蛋白耦联超受体家族,主要有Y1、Y2、Y4、Y5和Y6五个亚型,其中Y1和Y2受体与调控骨代谢紧密相关。在骨内,神经肽Y主要是经过Y1受体来发挥其效应；而在中枢神经系统中神经肽Y通过下丘脑上的Y2受体对骨代谢调控发挥作用。迄今已有不少体内和体外细胞学实验证实,神经肽Y及其受体对调控骨再生、重塑、形成机制作用重要,但神经肽Y对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的生物学效应仍存争议且作用机制不明确。因此,进一步研究明确神经肽Y对骨髓间充质干细胞的成骨分化效应有助于了解神经肽在骨代谢过程中的作用。骨折愈合过程中是多种组织、因子之间错综复杂的协同效应,骨折端多种促进骨折愈合的蛋白以及血管的新生对骨折愈合起着十分重要的作用。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是其中一种重要的蛋白,能够在骨折愈合过程中促进骨再生和骨重建。在骨形态发生蛋白家族中骨形态发生蛋白2(BMP-2)促进成骨效应最为明显。而血管新生是成骨发生的先决条件,血管的生成不仅能恢复骨折断端的血流,为骨的发育供给营养成分,还能通过生长因子调控成骨细胞活性以促进成骨。血液供应的重建在骨生理中的作用也已被众多研究探讨并证实了其重要性。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作为最强的促血管生成因子,对骨折愈合过程中血管的新生与周围组织血供的维持起着重要的作用。因此,探讨骨形态发生蛋白2以及血管内皮生长因子的表达与神经肽Y调控骨髓间充质干细胞成骨分化的相关性可能是NPY调控骨折愈合生理过程的重要环节。细胞生物学效应与细胞信号通路的关系密不可分。经典Wnt/β-catenin信号通路是骨代谢生理的关键通路因素,已有实验证实Wnt/β-catenin信号通路在骨生理和骨形成等过程中起重要作用,激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进骨形成并增加骨量。经典Wnt信号通路可以概括为β-链蛋白(p-catenin)在细胞质内积聚,积累到一定程度时P-catenin转移进入细胞核内引起下游Wnt相关靶基因转录表达。目前经典Wnt/β-catenin信号通路对于神经肽Y作用后骨髓间充质干细胞成骨分化的作用以及其与BMP-2、VEGF等相关因子的协同作用等方面仍未见相关文献报道。因此NPY作用于BMSCs的生物学效应是否由经典Wnt信号通路介导有必要进行研究。基于以上背景,本研究以骨髓间充质干细胞为研究对象,探讨神经肽Y对其成骨分化以及BMP-2、VEGF等相关因子表达的影响,并从经典Wnt/β-catenin信号转导通路角度探讨其相关机制。本次研究将进一步加深目前对神经因素通过神经肽调控骨折愈合的分子机制的认识,以及为其在骨折以及骨代谢疾病中的临床应用提供新的思路和实验依据。本实验主要的实验材料、方法、内容和结论主要包括以下几个部分：总体研究目的1.神经肽Y对大鼠BMSCs成骨分化的影响；2.神经肽Y在大鼠BMSCs成骨分化过程中BMP-2、VEGF表达的影响；3.神经肽Y调控大鼠BMSCs生物学效应与其相关Wnt通路的初步探讨。第1部分 神经肽Y对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响研究目的：通过全骨髓贴壁法获取SD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式鉴定法鉴定其纯度,同时探讨不同浓度神经肽Y对BMSCs成骨分化的影响。实验方法：1. BMSCs细胞获取、培养及鉴定选取实验动物80-100g左右的SD大鼠(雌雄不限),按照实验动物伦理学要求采用颈椎脱臼法处死大鼠,于清洁条件无菌器械辅助下,逐层切开大鼠解剖结构后获取大鼠双侧的股骨及胫骨。使用注射器针头冲洗骨髓腔直至骨髓腔两端泛白,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基(低糖)行全骨髓法分离培养BMSCs。培养两到三天后,换液去除未贴壁的血细胞等,按照1：2的接种比例经胰酶消化后传代至25 cm2培养瓶中,采用含体积分数10%胎牛血清及体积分数1%青链霉素混合液的DMEM培养基进行培养。培养瓶内培养基每2-3天换液1次,大约7天左右细胞生长铺满瓶底后可传三代,胰酶消化后按1：2传代,通过光镜及倒置显微镜观察SD大鼠BMSCs生长及形态变化特点。取三代BMSCs不含EDTA胰酶消化,PBS冲洗细胞3次计数,采用流式鉴定法检测表面标记CD29、CD34、CD44、CD45表达情况。2.实验分组处理将细胞分为四组,对照组(加入等量PBS), NPY(10-8mol/L)组,NPY(10-10 mol/L)组,NPY (10-12mol/L)组,将3代的BMSCs更换成骨诱导培养液(10mM β-甘油磷酸钠,100 nM地塞米松,5Oμg/mL维生素C,10% FBS, a-MEM)进行成骨诱导培养,于培养7、14天对细胞进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色；培养7、14、21天采用q-PCR法检测各组成骨标志物ALP,Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ),骨钙素(osteocalcin)及Runx2的基因表达情况,Western blot法检测ALP蛋白表达情况,以确定在成骨诱导环境下NPY对BMSCs成骨分化调控效应的浓度特异性。3.碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测细胞成骨染色取第三代BMSCs,更换成骨诱导培养液,于成骨诱导第7天对细胞进行ALP染色,PBS清洗三遍后在96孔板内加入甲醇固定,随后加入ALP染液,冲洗封片。于培养14天对细胞进行茜素红染色,PBS冲洗后经24孔板内加入95%酒精固定细胞,然后茜素红染色5min;蒸馏水冲洗若干次,干燥,封片。最后放置显微镜下观察成骨诱导效果并拍照。4. q-PCR、Western blot检测成骨基因和蛋白表达提取实验组总RNA后进行逆转录反应,荧光定量测定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin及Runx2含量。相关结果于7天、14天和21天分别测定三次。提取实验组ALP蛋白后,定量测定ALP蛋白表达。实验结果：在体外可通过全骨髓贴壁法成功分离培养出可用于实验的较高纯度大鼠BMSCs。经流式细胞术鉴定结果显示CD29 (92.4%±1.6%), CD34 (5.1%±1.3%), CD44 (86.7%±3.1%),, CD45(9.2%±2.5%),符合骨髓间充质干细胞的免疫表型特征。不同浓度NPY作用于BMSCs可不同程度提高成骨标志物以及ALP蛋白水平表达,其中以NPY (10-10mol/L)浓度调控成骨效应最为强烈。实验结论：神经肽Y可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。第2部分 神经肽Y在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中对骨形成蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响研究目的：探讨不同浓度NPY在BMSCs成骨分化中对BMP-2和VEGF表达的影响。实验方法：1.实验分组处理将细胞分为四组,对照组(加入等量PBS),NPY(10-8mol/L)组,NPY(10-10 mol/L)组,NPY (10-12mol/L)组,将3代的BMSCs更换成骨诱导液(10mMβ-甘油磷酸钠,100 nM地塞米松,50μg/mL维生素C,10% FBS, a-MEM)进行成骨诱导培养,于培养7、14、21天对细胞进行DAB免疫组化染色,采用q-PCR和Western blot法检测BMP、VEGF基因和蛋白的表达情况。2.免疫组织化学法测定BMP-2和VEGF表达取三代细胞进行实验处理后,甲醇固定液固定半小时后,使用体积分数为0.1%Triton X破膜10分钟。封闭内源性过氧化物酶。脱脂牛奶室温封闭10min。加入VEGF、BMP2一抗孵育,4-C避光孵育过夜,二抗室温下孵育30mmin,二氨基联苯胺(DAB)对细胞质进行显色。干燥,封片。最后放置显微镜下观察成骨诱导效果并拍照。3. q-PCR和Western blot法检测BMP-2、VEGF基因和蛋白的表达取三代细胞进行实验处理后,提取实验组总RNA后进行逆转录反应,荧光定量测定BMP-2、VEGF含量。相关结果于7天、14天和21天分别测定三次。提取实验组BMP-2、VEGF蛋白后,定量测定BMP-2、VEGF蛋白表达。实验结果：免疫组织化学结果显示在神经肽NPY作用后的第7、14、21天,BMP-2和VEGF的DAB染色阳性,细胞质呈棕黄色。q-PCR和Western blot结果示NPY作用于BMSCs后7、14、21天,可提高BMP-2、VEGF基因和蛋白的表达。实验结论：在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,神经肽Y可以促进细胞表达BMP-2和VEGF,且效应具有浓度特异性。第3部分神经肽Y调控BMSCs生物学效应及其相关Wnt通路的初步探讨研究目的：初步探讨NPY调控BMSCs生物学效应及其与经典Wnt通路相关性。实验方法：1.实验分组处理根据上述实验所确定的NPY浓度,取三代BMSCs,将细胞分为四组,对照组(加入等量PBS), NPY (10-10mol/L)组,NPY (10-10mol/L)+NPYY1受体拮抗剂组PD160170 (1μM)组以及NPY (10-10mol/L)+Wnt通路拮抗剂DKK1(0.2μg/mL)组。q-PCR测定成骨标志物ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2、BMP-2和VEGF基因以及Wnt信号通路相关基因β-Catenin基因的表达,Western blot法检测Wnt信号通路相关蛋白β-Catenin和p-GSK-3β蛋白的表达。2. q-PCR、Western blot法检测Wnt通路和成骨标志物基因、蛋白表达提取实验组总RNA后进行逆转录反应,荧光定量测定ALP, collagen type Ⅰ, osteocalcin、Runx2和β-Catenin含量。相关结果于培养7、14、21天分别测定三次。提取实验组β-Catenin和P-GSK-3β蛋白后,定量测定β-Catenin和P-GSK-3β蛋白表达。3.免疫细胞荧光法检测β-catenin蛋白定位取三代BMSCs进行实验处理后,甲醇固定液处理30分钟后,使用体积分数0.1%Triton X破膜10分钟,脱脂牛奶封闭抗体30分钟,随后用以1：300稀释的β-catenin一抗PBST溶液在4。避光条件下孵育过夜。PBS冲洗三次后,加入FITC绿色荧光二抗在室温下避光孵育30分钟,吸出液体后使用DAPI染色15分钟,放置荧光显微镜下观察并拍照。实验结果：10-10mol/L浓度的NPY能明显提高BMSCs细胞成骨标志物、Wnt/β-catenin信号转导通路相关基因的表达,同时能提高β-catenin蛋白和β-GSK-3β蛋白的表达,并可促进β-catenin蛋白转移进入细胞核,NPYY1受体拮抗剂、Wnt信号通路抑制剂DKK1能明显抑制NPY的这些作用。实验结论：神经肽Y调控骨髓间充质干细胞的生物学效应调控机制可能与经典Wnt信号转导通路的激活有关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R683

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