冻干血小板促进创伤愈合及止血作用的实验研究

发布时间：2018-01-11 04:31

本文关键词：冻干血小板促进创伤愈合及止血作用的实验研究　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。众所周知,血小板的主要功能是粘附、聚集于破损血管处,起止凝血作用。创伤发生后,血小板迅速粘附、聚集于创伤出血处,形成较松软的止血栓,血小板聚集形成止血栓的同时为凝血酶原复合物的激活提供磷脂表面,促进血凝块的形成。血凝块中的血小板可伸出伪足进入纤维网孔中,通过血小板收缩蛋白收缩,使血凝块回缩,挤压出其中血清成为坚实的止血栓。血小板的这一功能被认为已完全研究清楚。近年来,国内外学者研究发现血小板在创伤修复中有重要作用,因而受到学者们的青睐,引发了新的研究热点。血小板在创伤发生后止血过程中被激活,脱颗粒能释放包括血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor PDGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β1 TGF-β1)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(transforming growth factor beta FGF-b)和胰岛素样生长因子I (insulin-like growth factor-I IGF-I)等在内的多种生长因子,这些生物活性物质在整个创伤修复过程中发挥着促进细胞增殖、血管形成和细胞外基质沉积等作用。血小板比我们先前认为的更重要、更复杂；越来越多的证据表明血小板除了止凝血功能外,对于创伤修复也具有非常重要的作用。富血小板血浆(platelet rich plasma PRP)是血小板的常规应用形式,然而,PRP在(22±2)℃条件下振荡保存时间仅为5天,存在细菌生长引起败血症的危险性,且储存和运输不方便,限制了其应用。为了解决血小板保存期限短的问题,学者们研究出了新的血小板保存方式一深低温冰冻保存,即冰冻血小板,保存期限可达1年。但是,血小板冰冻过程中加入了二甲基亚砜(DMSO),DMSO超出一定浓度会对人体产生毒害作用,且冰冻血小板(frozen platelet FP)保存需要大型深低温冷冻保存设备,不方便运输。相比之下,冻干血小板(Freezing-dried platelets FDP)具有体积小、质量轻、可实现室温下长期储存和方便运输的优点而备受关注。为了获得结构功能完整的FDP,本课题组前期已对多种血小板冻干预处理保护液配方、冰冻及真空干燥等条件进行筛选,得到最优血小板冻干工艺。但FDP经历了冰冻前预处理、深低温冰冻、真空干燥及复水化等过程后,FDP的结构和功能受到一定程度的损害,在血小板表面糖蛋白表达及体外实验中,表现出与新鲜PRP不尽相同的特征。FDP的这些变化对其止血、促创面愈合功能的影响需要进一步验证。本研究中,本人采用本课题组前期优选出的血小板冻干工艺,对血小板进行冰冻干燥,获得了FDP,并将FDP样品复水化后进行生长因子含量检测,发现FDP中部分生长因子高于新鲜PRP,为证明FDP的有效性,本人从细胞增殖、动物急性创伤修复和外伤止血实验研究了FDP促进创伤愈合及止血的效果,也对FDP进行初步安全性评价。第一章第一节、血小板冻干前后生长因子含量检测本研究采用ELISA法检测血小板冻干前后释放PDGF-BB、TGF-β1、VEGFβ EGFβIGF-IβFGF-b六种生长因子的含量。FDP被激活后上清中PDGF-BB含量为(421.81±44.09) pg/ml,略低于PRP激活后上清的(390.94±22.43) pg/ml,差异无统计学意义(P0.05),其他5种生长因子含量均高于PRP激活后上清,差异有统计学意义(P0.05)。根据检测结果分析,推论FDP具有优于PRP的释放生长因子的能力。第一章第二节、FDP促血管内皮细胞增殖活性检测基于本实验室前期工作建立的最优血小板冻干工艺,本人首先按照该流程制备FDP,并进行复水化。将复水化的FDP与同一来源的新鲜PRP在相同实验条件下,用凝血酶-葡萄糖酸钙溶液激活,离心取上清液作用于HUVEC,检测FDP对血管内皮细胞的促增殖效果。研究结果显示,FDP、PRP及FBS均可促进人脐静脉内皮细胞的增殖,随着血小板生长因子提取液在培养基中浓度的增加,FDP及PRP组细胞增值率下降,差异显著(P0.05)；除培养48h时,5%FDP的促细胞增殖作用明显高于5%FBS,在相同浓度条件下,各检测时间点,FDP及PRP具有与FBS相近的促细胞增殖作用。本实验证明了,在相同浓度百分比条件下,FDP能产生与PRP、FBS相近的促进HUVEC增殖的效果。第一章第三节、FDP对SD大鼠急性创伤的治疗作用创伤修复是一个涉及多种细胞及其产物协同对细胞外基质进行重建和再生的过程,包括止血期、炎症期、增生期及朔形期。在这一既连续又部分重叠的过程中,需要多种细胞因子的协同作用发挥生物学效应,表现以炎症细胞浸润、成纤维细胞增生,血管形成和胶原纤维沉积等为其鲜明特点。前面的研究,我们已经发现FDP具有优于PRP的释放生长因子的能力,并具有与PRP相近的体外促进血管内皮细胞增殖的作用。为进一步证明其促创面修复作用,本人利用SD大鼠全层皮肤缺损创伤动物模型,采用FDP、PRP及重组人表皮生长因子(rhEGF)进行促创伤愈合速度及质量比较研究,同时,与不进行治疗的空白对照组进行比较,以评价FDP促进创伤修复的效果。结果显示,实验第7天,FDP组、PRP组和rhEGF组创面愈合率相近(P0.05),分别为(45.08±15.42)%、(46.97±11.48)%和(42.12±11.95)%,均明显高于空白对照组的(31.41+12.84)%(P0.05)；实验第10天,FDP组、PRP组和rhEGF组创面愈合率分别为(72.87±13.29)%、(82.7±6.34)%和(71.43±9.81)%,均明显高于空白对照组的(47.0±18.27)%(P0.05),PRP组与另两个实验组之间差异明显(P0.05)；病理切片检查提示,FDP与PRP的使用缩短了创伤炎症期,加速了创面再上皮化,促进了细胞增生、血管形成及胶原纤维的生成和成熟。由此可见,FDP具有与PRP相近的促进急性创面愈合的作用。第二章、FDP外伤止血作用的实验研究新鲜PRP的止血作用已经得到了充分证实,经过冻干处理后FDP的止血作用尚需实验验证,为此本人建立了新西兰白兔耳动脉出血模型,通过比较FDP、冻干冷沉淀(Freeze-dried cryoprecipitate FDC)、和两者联合(FDPC)使用对外伤性小动脉出血的止血作用,评价FDP的止血效果。结果显示：FDP组、FDC组及FDPC组的止血时间和出血量均明显少于BC照组,差异有统计学意义(P0.01);而FDP组与FDC组间止血时间及失血量差异显著(P0.01);与单独使用冻干血小板或冻干冷沉淀相比,FDPC组止血时间显著性缩短,失血量明显减少,差异有统计学意义(P0.01)。通过本实验,可以得出结论：FDP具有优于FDC的对外伤小动脉出血的止血效果；与单独使用FDP或FDC相比,两者联合使用具有更显著的止血效果。第三章、FDP的初步安全性评价同种异体血小板已广泛应用于临床静脉输注及创伤修复,获得了令人满意的治疗效果,很少报道不良反应。FDP制备过程中添加了外源性物质,且冻干过程对血小板存在一定程度的影响,为了发现这些外源性物质及冻干过程对血小板的改变可能导致的不良反应,本人对FDP进行初步安全性评价实验,为其进入临床前研究提供安全性评价理论基础。本人采用动物体内实验,选择单次皮肤刺激实验和重复给药毒性实验评价FDP安全性。实验结果显示FDP对SD大鼠及新西兰白兔皮肤没有明显的刺激反应,28天局部损伤皮肤连续涂敷,对白兔无明显毒性反应,说明FDP作为外敷生物制剂相对安全。综上所述,本研究制备的FDP保留了PRP生长因子释放,促进创伤愈合及止血的功能,作为局部外用新型血液制品是安全无明显毒副作用的。
[Abstract]:Platelet - derived growth factor ( PDGF ) , transforming growth factor 尾 ( TGF - 尾1 ) , vascular endothelial growth factor ( VEGF ) , epidermal growth factor ( EGF ) , basic fibroblast growth factor ( bFGF - b ) and insulin - like growth factor - I ( insulin - like growth factor - I IGF - I ) . In order to solve the problem of short shelf life of FDP , it has been shown that FDP has the advantages of small volume and light weight , which can realize long - term storage and convenient transportation of FDP . In this study , it has been found that FDP has the advantages of small volume and light weight , and it can realize long - term storage at room temperature and convenient transportation . In this experiment , FDP , PRP and human epidermal growth factor ( rhEGF ) were used to promote the proliferation of human umbilical vein endothelial cells . The results showed that FDP , PRP and FBS could promote the proliferation of human umbilical vein endothelial cells . The results showed that FDP had better hemostatic effect than that of control group ( 47.0 卤 18.27 ) % and ( 71.43 卤 9.81 ) % , which was significantly higher than that in control group ( P < 0.01 ) . It has the functions of promoting wound healing and stopping bleeding , and is safe and has no obvious toxic and side effect as a novel blood product for topical application .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R641

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