过表达SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移的体外研究

发布时间：2018-01-18 14:47

  本文关键词：过表达SDF-1α促进骨髓间充质干细胞迁移的体外研究　出处：《福建医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的研究表明,SDF-1/CXCR4轴不仅能够促进移植后的BMSCs向损伤组织迁移,而且具有抑制BMSCs凋亡、增加BMSCs的存活率及增强BMSCs增殖活性等作用,从多方面提高BMSCs向损伤组织的归巢效率。因此我们设想通过转基因技术将外源性SDF-1基因导入BMSCs,提高SDF-1在BMSCs的表达率,从而增强BMSCs的迁移能力。方法1.构建过表达SDF-1α重组慢病毒载体(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP),进行PCR、双酶切及测序鉴定;2.将已经构建好的慢病毒载体质粒p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP、p NL-IRES2-EGFP、GV-118-SDF-1α-si RNA与其辅助质粒共同转染293T细胞,包装生产慢病毒,并进行病毒浓缩和功能滴度测定;用相同滴度的过表达SDF-1α慢病毒、空载体慢病毒、SDF-1α基因沉默慢病毒转导BMSCs,建立稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系;采用RT-PCR、Western Blot的方法检测三组中SDF-1αm RNA和蛋白的表达水平;3.Transwell迁移实验检测SDF-1α对BMSCs迁移的影响;抗SDF-1α多抗阻断后观察细胞迁移的变化。结果1、成功构建SDF-1α重组慢病毒载体(p NL-SDF-1α-IRES2-EGFP质粒)。2、慢病毒转染48h后可在倒置荧光显微镜下观察到大量293T细胞表达EGFP,EGFP阳性率可达95%以上,转SDF-1α基因、空载体及SDF-1α基因沉默BMSCs强烈表达EGFP。RT-PCR、Western Blot证实SDF-1α-BMSCs组过表达SDF-1α,si RNA-BMSCs组SDF-1α表达明显被抑制。3、Transwell迁移实验提示SDF-1α可明显促进BMSCs的跨膜迁移。SDF-1α-BMSCs组及null-BMSCs组在抗SDF-1α多抗作用后迁移指数明显下降,而si RNA-BMSCs组抗体阻断后与阻断前无明显差异。结论利用成功构建过表达SDF-1α基因及SDF-1α基因沉默慢病毒载体包装生产慢病毒,进而感染BMSCs,通过RT-PCR、Western Blot检测SDF-1αm RNA、蛋白的表达水平,证实过表达SDF-1α能增强BMSCs中SDF-1α基因表达,而SDF-1α基因沉默能抑制BMSCs中SDF-1α基因表达,Transwell迁移实验表明,过表达SDF-1α促进BMSCs跨膜迁移,而SDF-1α基因沉默后这种迁移明显被抑制。加入抗SDF-1α后,BMSCs跨膜迁移的细胞数明显减少。
[Abstract]:Objective to demonstrate that the SDF-1 / CXCR4 axis can not only promote the migration of BMSCs to injured tissue, but also inhibit the apoptosis of BMSCs. The survival rate of BMSCs and the proliferative activity of BMSCs were increased. In order to improve the homing efficiency of BMSCs to damaged tissues in many ways, we envisage the introduction of exogenous SDF-1 gene into BMSCs by transgenic technology. The expression rate of SDF-1 in BMSCs was increased. Methods 1. Construction of recombinant lentivirus vector expressing SDF-1 伪 -IRES2-EGFPN for PCR. 2. Double enzyme digestion and sequencing; 2.Recombinant lentivirus vector p NL-SDF-1 伪 -IRES2-EGFPP NL-IRES2-EGFP was constructed. GV-118-SDF-1 伪 -si RNA was co-transfected into 293T cells with its coplasmid to produce lentivirus, and the virus concentration and function titer were determined. SDF-1 伪 lentivirus was over-expressed with the same titer, and the empty vector lentivirus SDF-1 伪 gene silenced lentivirus transduction BMSCs. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with stable overexpression of SDF-1 伪 were established. The expression of SDF-1 伪 m RNA and protein in the three groups was detected by RT-PCR Blot. 3. The effect of SDF-1 伪 on BMSCs migration was detected by Transwell migration experiment. The changes of cell migration were observed after blocking SDF-1 伪 polyclonal antibody. Results 1. The recombinant lentivirus vector of SDF-1 伪 was successfully constructed. The plasmid of p NL-SDF-1 伪 -IRES2-EGFP was constructed. After 48 hours of lentivirus transfection, a large number of 293T cells were observed to express EGFP-EGFP-positive rate of more than 95% under inverted fluorescence microscope, and the expression rate of EGFP-a gene was higher than 95%. The empty vector and SDF-1 伪 gene silenced BMSCs strongly expressed EGFP.RT-PCR. Western Blot confirmed that the overexpression of SDF-1 伪 in SDF-1 伪 -BMSCs group was significantly inhibited in RNA-BMSCs group. Transwell migration experiment showed that SDF-1 伪 could significantly promote the transmembrane migration of BMSCs. SDF-1 伪 -BMSCs group and null-BMSCs group in anti-#en4# 伪. The migration index decreased significantly after the action of multiple reactives. And si... There was no significant difference between the antibody of RNA-BMSCs group and that before blocking. Conclusion Lentivirus can be produced by successfully constructing SDF-1 伪 gene and SDF-1 伪 gene silencing lentivirus vector. The expression level of SDF-1 伪 m RNAs and protein was detected by RT-PCRG Western Blot. It was proved that overexpression of SDF-1 伪 could enhance the expression of SDF-1 伪 gene in BMSCs, while SDF-1 伪 gene silencing could inhibit the expression of SDF-1 伪 gene in BMSCs. Transwell migration assay showed that overexpression of SDF-1 伪 promoted the transmembrane migration of BMSCs, while that of SDF-1 伪 gene was significantly inhibited after the silencing of SDF-1 伪 gene. The number of cells transmembrane migration of BMSCs was significantly decreased.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

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本文编号：1441372