NM23-E2在大鼠减体积肝移植术后肝细胞再生中的作用

发布时间：2018-01-22 02:12

本文关键词： 减体积肝移植大鼠模型 NM23-E2载体 shRNA载体 PCNA Cyclin D1 减体积肝移植　出处：《昆明医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分大鼠减体积肝移植模型的建立目的：建立稳定的大鼠减体积肝移植模型；为进一步进行大鼠减体积肝移植术后肝脏再生的研究提供重要的技术平台和前提条件。方法：1.实验大鼠均为健康的SD大鼠体重260-280g,供体为雌性,受体为雄性,供、受体体重相差10g左右,一般为供体体重比受体体重轻。2.供体单人裸眼操作,在取肝的过程中即进行减体积操作。在供肝切取过程中切除肝脏的左外侧叶、三角叶和尾状叶(约占全肝体积的40%-50%),修肝时将套管柄置于门静脉和肝下下腔静脉的正前方,将幽门静脉结扎点外翻于套管外并置于套管柄的左侧,即肝脏的左侧；将右肾静脉结扎点外翻于套管外并置于套管柄的右侧,即肝脏的右侧；供肝套管完成后用灌注液对门静脉和肝下下腔静脉进行冲洗；然后以左膈静脉为标识点进行8-0无损伤血管缝线吊线。3.受体切肝前单人裸眼操作,从新肝移植开始采用双人裸眼配合操作；供体完成胆道支撑架安置以后,受体即开始手术；肝上下腔静脉吻合时,左、右侧予以“8”字缝合固定,后壁和前壁均采用连续缝合予以吻合,门静脉和肝下下腔静脉采用双袖套法,胆道支撑管法,建立大鼠减体积的稳定模型。4.术后观察大鼠一般恢复情况,解剖死亡大鼠了解死因。结果：减体积肝移植模型供体手术时间为32±2min,修肝时间为7±2min,受体手术时间为44±3min,无肝期时间为18±3min,供肝的冷保存时间为51±3min。手术的成功率为92%,术后1d的存活率为95%,术后3d的存活率为85%,术后5d存活率为80%,术后7d存活率为75%。结论：1.大鼠减体积模型采用供体灌注完成后,在供肝切取的过程中进行相应肝叶的切除,即可获得高质量、满意的减体积供肝。供、受体手术配合,尽量的缩短供肝的冷保存时间。精细血管吻合技术缩短无肝期、减少术后出血,对诸多细节操作的改进等。这些可以尽量的减少大鼠减体积肝移植术中和术后的并发症,提高大鼠减体积肝移植模型的成功率和长期生存率。是一种值得推广的大鼠减体积肝移植模型。2.成功的大鼠减体积肝移植模型的建立,为下一步进行大鼠减体积肝移植术后肝脏的再生的研究提供了研究的基础和前提。第二部分NM23-E2在大鼠减体积肝移植术后肝细胞再生中的作用目的：探讨在成功建立大鼠减体积肝移植模型的基础上；探讨NM23-E2基因作用于肝移植术后肝脏再生的进展阶段,通过调节肝脏增殖周期的Cyclin D1及增殖细胞核抗原(PCNA)而对肝细胞再生起到积极的促进作用。方法：以第一部分所建成功的大鼠减体积肝移植模型为基础,实验分为五个组,减体积肝移植组(空白对照组),NM23-E2 NC组,NM23-E2过表达组,shRNA NC组,shRNA组。构建、扩增、筛选、鉴定及包装NM23-E2过表达、干扰慢病毒载体及各自阴性对照慢病毒载体,,在大鼠减体积肝移植门静脉套管前注射上述慢病毒载体,肝移植术后5天处死大鼠,获取肝脏标本,进行荧光蛋白检测,利用蛋白免疫印迹实验对各组肝组织NM23-E2、PCNA、Cyclin D1蛋白表达的检测,定量PCR检测各组肝组织NM23-E2、PCNA、Cyclin D1 mRNA表达变化情况,并用免疫组化检测三种蛋白阳性细胞表达情况。结果：在大鼠减体积肝移植门静脉套管前注射过表达及干扰的NM23-E2慢病毒载体5天后,相应的荧光蛋白在肝组织内有明显的表达,表明慢病毒载体携带的过表达及干扰基因已成功转染入供肝细胞。Western blot检测肝组织NM23-E2、PCNA、Cyclin D1蛋白的表达：NM23-E2过表达组三种蛋白表达量均高于对照组(P0.05),shRNA组三种蛋白表达量均低于对照组(P0.05),差异有统计学意义。Q-PCR检测肝组织NM23-E2、PCNA、Cyclin D1 mRNA的表达：NM23-E2过表达组三种蛋白mRNA的表达量均高于对照组(P0.05),shRNA组三种蛋白mRNA的表达量均低于对照组(P0.05),差异有统计学意义。对照组、NM23-E2过表达NC组、NM23-E2干扰NC组中三组蛋白及mRNA表达无明显变化(P0.05),差异无统计学意义。免疫组化显示:NM23-E2、PCNA、Cyclin D1蛋白阳性细胞在NM23-E2过表达组呈强阳性,在shRNA组呈阴性,在Control组、NM23-E2NC组和shRNANC组呈中度阳性和弱阳性。结论：运用慢病毒载体携带过表达及干扰的NM23-E2经门静脉可以有效地转染到供肝细胞。减体积肝移植后过表达的NM23-E2载体对减体积肝移植术后肝再生调控作用成正向调控作用,shRNA载体对减体积肝移植术后肝再生调控作用成负向调控作用。
[Abstract]:Objective : To establish a stable model for the reduction of liver regeneration after liver transplantation . The results showed that the survival rate of the donor was 92 % , the survival rate was 95 % , the survival rate was 85 % , the survival rate was 80 % , the survival rate was 75 % after operation . The expression of NM23 - E2 , PCNA , Cyclin D1 protein in liver tissues was studied by Western blot , and the expression of NM23 - E2 , PCNA , Cyclin D1 protein in liver tissues was determined by Western blot . The expression of NM23 - E2 , PCNA and Cyclin D1 in liver tissues was detected by Western blot . In the control group , NM23 - E2 , PCNA and Cyclin D1 positive cells were strongly positive in NM23 - E2 overexpression group , and the expression levels of NM23 - E2 , PCNA and Cyclin D1 were significantly positive in the control group , NM23 - E2NC group and shRNANC group .

【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3

【参考文献】