新型携氧微球改善外周神经损伤后局部缺氧微环境的实验研究

发布时间：2018-01-26 23:09

  本文关键词： 神经损伤 神经导管 PFTBA 嗅鞘细胞 缺氧微环境 双层微球 神经再生 功能恢复 壳聚糖 PLGA　出处：《第四军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：外周神经系统将大脑、脊髓与远端器官、系统相联系,使中枢神经系统可以有效,精确地支配机体的各项活动,又被称为周围神经系统。外周神经损伤,尤其是神经长节段缺损的修复,长久以来是再生医学领域以及临床工作中一个亟待解决的问题。自体神经移植一直以来被公认为外周神经修复领域的金标准,然而,其给供区带来的创伤,自身免疫排斥反应,供体受限,以及其本身的并发症,往往局限了自体神经移植的应用。随着组织工程学的发展,人工构建神经支架取代自体神经移植来桥接外周神经缺损成为了目前的研究趋势。但由于缺乏有效促进神经再生的刺激因素,人工支架的使用不能最大程度地发挥对神经再生的引导作用。因此,构建支架内部有利于神经再生的微环境具有非常重要的意义。目前,随着科学技术的发展,许多学者将种子细胞和神经因子植入神经支架内部,以促进神经损伤后的再生,为神经长节段缺损的修复提供了新的思路。但是,在种子细胞植入神经支架后早期,局部缺氧微环境可导致细胞凋亡,使植入的种子细胞不能充分发挥其活性。有研究利用PFTBA水凝胶改善局部缺氧微环境,从而促进种子细胞的存活。然而,该水凝胶无法有效的控制氧气的释放速率,使得其对早期缺氧微环境的改善存在局限性。因此,本研究通过制备双层携氧微球,在不同环境下对嗅鞘细胞的存活及活性进行评测,随后进行大鼠坐骨神经缺损神经导管桥接术并植入不同材料,评价该双层携氧微球对神经再生及其功能恢复的作用。本研究分为以下三部分:实验一 Cs-PLGA双层携氧微球的制备及理化性质鉴定背景:在种子细胞移植早期,由于支架内的局部氧分压难以支持功能细胞的存活,导致对缺损的修复不能达到预期的效果。有研究利用PFTBA水凝胶改善早期氧分压,并取得了一定的疗效。然而以水凝胶作为载体的携氧材料不能有效的控制氧气的释放,导致PFTBA过早的消耗殆尽。因此,如何进一步优化局部缺氧微环境成为了亟待解决的问题。目的:制备含不同浓度PFTBA的Cs-PLGA双层微球,并对其生物学性能进行检测。方法:以壳聚糖(Chitosan,Cs)与PLGA作为主要原料,应用乳化-离子交联技术制备搭载有不同浓度(5%、10%、20%)PFBTA的Cs-PLGA双层微球。应用扫描电镜及免疫荧光染色以及降解率的测定对其理化性质进行鉴定;通过对搭载不同浓度PFTBA的双层微球的释氧率进行测定,初步筛选出后续实验所需要的PFTBA浓度。此外,另制备Cs单层微球、PLGA单层微球与PLGA-Cs双层微球,填充入神经导管修复大鼠坐骨神经缺损,并每天测定局部氧分压,以分析不同微球的释氧特点。结果:通过扫描电镜及免疫荧光染色观察到Cs-PLGA双层缓释微球具有球形外观,其内部具有双层结构且PFTBA可充分的包埋在其中。Cs微球的平均粒径在35.34-40.18μm,PLGA微球的平均粒径在1.03-1.29μm之间,12周后降解率接近60%。Cs-PLGA双层微球中的PFTBA可持续释放至少28天。此外,搭载10%与20%PFTBA的双层微球中的氧含量在不同时间点明显高于搭载5%PFTBA的双层微球,且其两组之间并无明显差异。通过对局部氧分压的测定,发现不同的材料在氧气释放速率上有不同的特点。结论:Cs-PLGA双层携氧微球拥有明显的双层结构,且PFTBA可以有效的包埋在其中,同时还具备良好的平均粒径,降解率,在28天内持续的释放氧气,有效延长PFTBA内氧气释放的时间。此外,通过对氧分压的测定,我们发现Cs-PLGA微球的释氧特点更适合改善局部低氧微环境。该微球的制备为后续的体外、体内试验打下了良好的基础。实验二 探究Cs-PLGA双层携氧微球对嗅鞘细胞缺氧模型的保护与支持作用背景:随着神经组织工程技术的进步,研究者们发现:在损伤局部植入的嗅鞘细胞细胞可以通过大量分泌大量释放促神经再生的相关神经营养因子为神经的再生进程提供有利的微环境,从而对外周神经损伤后的神经再生起到了非常重要的促进作用。然而,植入的嗅鞘细胞最长存活周期不超过8周。此外,经过长时间培养的嗅鞘细胞不能够对神经元的存活与再生起到支持作用。近年来,大量研究表明缺氧是导致植入细胞死亡的最重要原因之一。因此,如何通过改善移植局部缺氧微环境促进细胞的存活,成为了目前神经组织工程领域面临的一个巨大挑战。目的:探讨搭载不同浓度PFTBA的Cs-PLGA双层微球在缺氧条件下对嗅鞘细胞的保护作用方法:对嗅鞘细胞进行分离培养与纯化后,根据实验一制备的搭载5%、10%、20%PFTBA的Cs-PLGA双层微球将本实验分为8组:(1)正常培养组(A组);(2)正常+5%PFTBA培养组(B组);(3)正常+10%PFTBA培养组(C组);(4)正常+20%PFTBA培养组(D组);(5)缺氧培养组(E组);(6)缺氧+5%PFTBA培养组(F组);(7)缺氧+10%PFTBA培养组(G组);(8)缺氧+20%PFTBA培养组(H组)。随后,通过流式细胞术与Presto Blue技术,检测各组细胞的凋亡与增殖情况。通过免疫荧光以及扫描电镜检测各组嗅鞘细胞的形态与数目变化。通过Elisa以及RTPCR检测不同条件下相关神经营养因子(NGF、BDNF、VEGF)的表达与分泌。结果:通过上述检测,发现在缺氧培养24h后,嗅鞘细胞开始发生凋亡,细胞的存活及其活性也明显受到影响,对相关神经营养因子的表达与分泌也出现下降,而在缺氧条件下使用搭载PFBTA的Cs-PLGA双层微球有效的抑制了细胞的凋亡,增加存活细胞的数目与形态也得到很好的改善,对相关神经营养因子的表达与分泌也较普通缺氧培养有所提高。其中,搭载10%与20%PFTBA的双层微球组的改善效果明显优于5%PFTBA组,而10%PFTBA组与20%组在上述结果之间无明显差异。结论:搭载10%与20%PFTBA的Cs-PLGA双层携氧微球均可有效的改善缺氧微环境,促进嗅鞘细胞的存活与活性。由于这10%PFTBA与20%PFBTA之间无明显差异,因此在后续体内实验中我们选择利用10%PFTBA的Cs-PLGA双层微球。第三部分 Cs-PLGA双层携氧微球-OECs复合系统修复大鼠坐骨神经损伤的有效性研究背景:利用神经导管桥接长节段缺损时,在神经导管内植入种子细胞,构建功能性导管可为神经再生提供物质和营养的支持,有效的促进神经再生与功能恢复。但在移植早期,导管内局部缺氧微环境不足以支持种子细胞的存活,充分发挥其活性,导致修复不能达到预期的效果。有研究利用PFTBA水凝胶联合嗅鞘细胞构建复合修复系统植入神经导管成功的桥接了大鼠坐骨神经15mm缺损。然而由于水凝胶载体具有强大突释特性,其中的PFTBA在移植术后短期迅速在局部释放,使局部氧分压不足以在长时间内一直维持在相对较高的水平。因此,如何进一步优化PFTBA这一氧气载体的应用,使其更有效地提高局部氧分压,并在相对较长的时间维持其在适当的水平,成为了本研究的焦点。目的:探讨搭载PFTBA的Cs-PLGA的双层微球与嗅鞘细胞复合神经导管桥接大鼠坐骨神经缺损后,促进神经再生以及功能恢复的效能。方法:根据动物模型的不同,将实验分为5组:自体神经移植组(A组)、空导管移植组(CF组)、搭载10%PFTBA的Cs-PLGA双层微球移植组(CFM组)、嗅鞘细胞移植组(CFO组)、Cs-PLGA双层微球-嗅鞘细胞复合移植组(CFOM组)。根据组别将不同干预因素填充入神经导管内,修复大鼠坐骨神经15mm缺损。通过形态计量学分析、免疫荧光染色评估神经再生的情况;通过对形态学分析、荧光金逆行示踪、神经电生理的检测以及术后靶肌肉的恢复情况以评估神经功能恢复的情况。结果:通过上述检测我们发现Cs-PLGA双层携氧微球与嗅鞘细胞的单独植入均可有效地促进了神经的再生及功能的恢复,但修复效果仍不如自体神经移植术。而在两者共同作用下,神经的再生与功能的恢复有着显著的改善,这种改善效果与自体神经术后的恢复效果并无明显差异。结论:Cs-PLGA双层微球与嗅鞘细胞的复合植入可通过改善移植术后局部缺氧微环境,促进植入种子细胞的存活与活性,从而改善术后神经的再生及神经功能的恢复。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R688
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本文编号：1466860