脊髓损伤后BDNF对损伤局部炎症反应及巨噬细胞极性的调解作用

发布时间：2018-01-28 09:27

  本文关键词： 巨噬细胞/小胶质细胞 巨噬细胞极性 BDNF 脊髓损伤 炎症反应　出处：《第三军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：大量研究证实脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)可以通过多种机制发挥其神经保护作用,进而抑制神经元的凋亡,促进轴突再生,调节突触传递,增强神经兴奋性,促进前体细胞的增殖和髓鞘再生。尽管有研究显示BDNF具有抗炎抗氧化作用,并且对免疫反应具有一定的调节作用,但SCI后BDNF对炎症反应的影响尚不明确。本课题通过系列研究证实SCI后损伤局部过表达BDNF可以明显改善炎症微环境,抑制促炎因子(IL-1β,TNF-a)的表达并上调抑炎因子(IL-10,IL-13)的表达,同时可以促进损伤区巨噬细胞/小胶质细胞表型由M1向M2转变。此外,BDNF对炎症反应的调解在一定程度上增强了其神经保护作用并显著促进了运动功能的恢复。第一部分:SCI后损伤中心处注射Lenti-BDNF载体成功过表达并以转染损伤局部炎症细胞为主材料与方法1.Lenti-BDNF载体构建;BDNF基因片段经PCR扩增,将扩增的BDNF基因片段交换入线性化GV208表达载体,获得GV208-BDNF慢病毒过表达质粒并转化感受态细胞。阳性克隆菌落行PCR鉴定,对重组质粒进行测序后将其与慢病毒包装系统共同转染293T细胞进行病毒包装,最后通过Real-time PCR法进行病毒滴度检测。2.C57BL/6脊髓损伤模型建立;通过建立两种常用SCI动物模型,T10节段背侧半切模型和T10节段动脉夹夹伤模型。选择适合于本课题慢病毒载体注射的SCI模型。3.损伤中心处Lenti-EGFP和Lenti-BDNF注射以及转染细胞种类的鉴定;通过立体定向仪以及汉密尔顿微量进样器向损伤中心处注射慢病毒载体,通过对损伤节段进行CD11b和GFAP免疫荧光染色,明确慢病毒转染细胞种类。4.各组损伤节段BDNF表达水平检测;慢病毒载体注射后第4天,通过ELISA检测各组损伤节段(自损伤中心处向头侧和尾侧各1.5mm)BDNF的表达水平。结果1.GV208-BDNF过表达质粒的阳性克隆鉴定显示测序结果与目标序列比对完全一致。慢病毒包装后Real time PCR法测定病毒滴度为2.00E+8TU/ml。2.T10节段背侧半切模型和动脉夹夹伤模型都可以破坏小鼠的皮质脊髓束(CST)并造成后肢运动功能的丧失,但夹伤模型能够更好的保护硬脊膜,减少病毒流失,更适合本课题研究。3.慢病毒注射后4天(脊髓损伤后第7天),共聚焦结果显示EGFP细胞广泛分布在损伤中心处,并且在转染EGFP的细胞中,CD11b阳性细胞的百分比分在lenti-EGFP和Lenti-BDNF组中均达到了80%以上,说明在损伤中心灶注射的慢病毒载体主要转染的细胞为损伤局部的炎症细胞。4.通过ELISA对损伤节段处BDNF的总体表达水平检测显示lenti-BDNF组(62.63±8.74 ng/g)的表达水平明显高于lenti-EGFP组(0.59±0.15 ng/g)以及saline组(0.68±0.13 ng/g)(P0.001)。结论1.Lenti-BDNF慢病毒包装成功,病毒滴度较高,能够满足实验需要。2.改良动脉夹夹伤模型能够更好的保护硬脊膜完整,更适合损伤局部慢病毒注射。3.损伤中心处注射的慢病毒载体主要转染的细胞为损伤局部的炎症细胞。此种注射方法有利于对BDNF在免疫炎症调节中的作用进行研究。4.通过ELISA定量检测证实,Lenti-BDNF载体在损伤节段成功过表达。第二部分SCI后损伤处过表达BDNF在免疫炎症调节和神经保护中具有显著作用第一节:损伤中心处过表达BDNF可以促进巨噬细胞表型由M1向M2转变并对炎症微环境具有明显的调节作用材料与方法1.实验对象;成年雌性C57BL/6小鼠跟据注射载体的不同分为:Lenti-EGFP组,Lenti-BDNF组和Saline组(于损伤中心处注射生理盐水)以及Sham组(仅进行椎板切除,不对脊髓造成损伤)。2.通过免疫荧光对巨噬细胞表型进行检测;对各组损伤组织切片进行CD16/32(M1标记物)和Arginase-1(M2标记物)免疫荧光标记,检测各组巨噬细胞表型的变化。3.通过流式细胞学进行M1/M2表型检测分析;对损伤节段进行取材(损伤中心至头侧和尾侧各1.5mm),消化,洗涤,过滤后获得单细胞悬液,然后予以M1表型(CD16/32,i NOS,)和M2表型(arginase-1,CD206)流式抗体孵育及检测。4.炎症因子的表达水平检测;对各组损伤节段促炎因子(TNF-a,IL-1β)和抑炎因子(IL-10,IL-13)的表达水平进行ELISA检测。5.在体外培养骨髓来源巨噬细胞(BMDM)过程中进行BDNF刺激,并通过q RT-PCR检测炎症因子的表达水平以及通过Western Blot检测arginase-1和i NOS的蛋白表达水平,以明确BDNF是否可以直接作用于对巨噬并对其表型产生影响。结果1.共聚焦结果显示脊髓损伤后lenti-BDNF组arginase-1阳性细胞数相比lenti-EGFP组和saline组明显增多(P0.05),而lenti-BDNF组CD16/32阳性细胞数比lenti-EGFP组和saline组明显减少(P0.05)。此外,与Lenti-EGFP组相比Lenti-BDNF组中未与EGFP共定位的Arginase-1+细胞百分比明显升高,同时未与EGFP共定位的CD16/32+细胞百分比显著降低(P0.05)。2.流式结果分析显示,与lenti-EGFP组和saline组相比,lenti-BDNF组中与M1表型相关的CD16/32和i NOS阳性细胞百分比明显下降,而与M2表型相关的arginase-1和CD206阳性细胞百分比显著上升。3.ELISA检测结果显示损伤局部过表达BDNF可以明显降低促炎因子IL-1β和TNF-α的表达,同时显著上调抑炎因子IL-10和IL-13的表达。4.在体外试验中,q RT-PCR检测经BDNF刺激的BMDM的炎症因子的表达与对照组无明显差异,Western Blot检测表型相关蛋白arginase-1和i NOS的表达与对照组亦无显著差异。结论1.SCI后损伤中心处过表达BDNF可以促进巨噬细胞由M1向M2表型转变,并且初步分析显示,损伤处巨噬细胞极性的转变可能并非通过BDNF直接作用于巨噬细胞引起的。2.过表达BDNF可以抑制促炎因子的表达并上调抑炎因子的表达水平,在改善炎症微环境中具有一定的作用。3.体外重组BDNF刺激BMDM后,并未引起巨噬细胞表型的改变,表明重组BDNF不能直接作用于巨噬细胞。第二节:损伤中心处过表达BDNF可以促进SCI后的神经损伤修复材料和方法1.运动功能评估;通过旷场试验对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF两组小鼠的行为学予以Basso Mouse Scale(BMS)评分,以评价BDNF对SCI后运动功能恢复的影响。2.脱髓鞘检测;通过对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF组脊髓损伤节段矢状位切片进行Luxol Fast Blue(LFB)染色,以评估BDNF对髓鞘的保护作用。3.BDA(Biotinylated dextran amine)示踪;脊髓损伤后14天向小鼠运动皮层予以BDA注射,对损伤后的皮质脊髓束(CST)进行示踪,观察BDNF对CST轴突回缩的影响。4.对损伤局部神经纤维的影响;通过对Lenti-EGFP和Lenti-BDNF损伤节段进行NF-200免疫荧光染色,观察BDNF对损伤局部神经纤维的影响。结果1.通过对两组小鼠损伤后1,3,7,14,28天进行BMS评分显示,亚急性期Lenti-BDNF组的小鼠运动功能恢复较Lenti-EGFP组明显提高。2.LFB染色结果显示Lenti-BDNF组脱髓鞘程度较Lenti-EGFP组明显减轻。3.结果显示Lenti-BDNF组CST轴突末端距离损伤边缘较Lenti-EGFP组明显缩短,表明过表达BDNF可以显著减少CST的轴突回缩。4.NF-200免疫荧光染色结果显示损伤中心处过表达BDNF可以明显抑制神经纤维的崩解,具有明显的神经保护作用。结论SCI后损伤局部过表达BDNF能显著促进神经损伤修复,具有明显的神经保护作用。但需要注意的是:损伤中心处注射慢病毒载体以转染损伤局部炎症细胞为主,而并非损伤周围的神经元、轴突、少突胶质细胞等。所以本研究中BDNF对免疫炎症反应的调节作用在神经保护中可能起了重要的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;豚鼠巨噬细胞经P_(204)处理后的抗石英细胞毒作用[J];国外医学参考资料(卫生学分册);1976年04期

2 邓侠进;;巨噬细胞的抗癌作用[J];遵义医学院学报;1979年02期

3 陆天才;;疾病对肺巨噬细胞的影响[J];煤矿医学;1982年01期

4 郭瑞清;祝彼得;;一种分离巨噬细胞的简单方法[J];滨州医学院学报;1990年02期

5 谢志坚;巨噬细胞异质性[J];医学综述;2001年06期

6 饶艳;运动及神经内分泌对巨噬细胞功能的调节[J];体育与科学;2002年05期

7 朱金元;;吸烟对肺巨噬细胞的影响[J];浙江医学教育;2003年01期

8 张俊峰;过氧化物酶体增殖物激活受体与单核/巨噬细胞系[J];医学综述;2004年03期

9 韦锦学;顾军;;巨噬细胞的激活诱导死亡[J];生命科学;2006年02期

10 李晓曦;郭宁;曹雪涛;;肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤生长与转移的研究现状[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2008年01期

相关会议论文 前10条

1 史玉玲;王又明;丰美福;;巨噬细胞激活作用的研究[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

2 吴国明;周辉;;巨噬细胞和创伤纤维化[A];2009年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明质酸对于淋巴结巨噬细胞运动的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

4 刘革修;欧大明;刘军花;黄红林;廖端芳;;丙丁酚在体外能抑制巨噬细胞脂质氧化介导的低密度脂蛋白氧化并调节氧化巨噬细胞的分泌功能[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

5 叶金善;杨丽霞;郭瑞威;;环氧化酶-2/前列腺素E_2在血管紧张素Ⅱ刺激巨噬细胞表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子中的作用[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年

6 秦帅;陈希;孔德明;;构建由绿色荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系[A];贵州省中西医结合内分泌代谢学术会论文汇编[C];2012年

7 武剑华;徐惠绵;;肿瘤相关巨噬细胞在胃癌中的相关研究[A];第9届全国胃癌学术会议暨第二届阳光长城肿瘤学术会议论文汇编[C];2014年

8 何军;;血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体升高巨噬细胞内胆固醇水平[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢达;;PDT诱导的凋亡细胞对巨噬细胞NO合成的影响[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年

10 张磊;朱建华;黄元伟;姚航平;;血管紧张素Ⅱ对巨噬细胞(THP-1重细胞)凝集素样氧化低密度脂蛋白受体表达的影响[A];浙江省免疫学会第五次学术研讨会论文汇编[C];2004年

相关重要报纸文章 前10条

1 通讯员 李静 记者 胡德荣;恶性肿瘤巨噬细胞未必皆“恶人”[N];健康报;2014年

2 兰克;以尝试用巨噬细胞治瘫痪[N];科技日报;2000年

3 薛佳;免疫系统——人体的“卫士”[N];保健时报;2009年

4 记者 胡德荣;铁泵蛋白“维稳”铁代谢作用首次阐明[N];健康报;2011年

5 侯嘉 何新乡;硒的神奇功能[N];中国食品质量报;2003年

6 唐颖 倪兵 陈代杰;巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行[N];中国医药报;2006年

7 刘元江;新发现解释肿瘤为何易成“漏网之鱼”[N];医药经济报;2007年

8 本报记者 侯嘉 通讯员 何新乡;今天你补硒了吗[N];医药经济报;2003年

9 左志刚;升血小板药使用注意[N];医药养生保健报;2007年

10 记者 许琦敏;“铁泵”蛋白帮助回收铁元素[N];文汇报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 周赤燕;巨噬细胞MsrA对动脉粥样硬化的干预研究[D];武汉大学;2013年

2 章桂忠;TIPE2蛋白调控细胞增殖和炎症的机制研究[D];山东大学;2015年

3 张瑜;DKK1抑制巨噬细胞内脂质沉积及其相关分子机制[D];山东大学;2015年

4 孟涛;异丙酚对心脏收缩功能的抑制作用及其对巨噬细胞分泌功能调节的机制研究[D];山东大学;2015年

5 周兴;基于酵母微囊构建新型口服巨噬细胞靶向递送系统的研究[D];第三军医大学;2015年

6 蒋兴伟;Tim-3对巨噬细胞极化的调控机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

7 刘伯玉;清道夫受体A介导小鼠巨噬细胞吞噬钩端螺旋体研究[D];上海交通大学;2013年

8 杨绍俊;miRNA-155介导ESAT-6诱导巨噬细胞凋亡的分子机制及其在结核诊断中的作用[D];第三军医大学;2015年

9 翟光耀;单核/巨噬细胞Ly6C~(low)亚群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京协和医学院;2014年

10 韩露;TRB3介导的脂肪组织巨噬细胞极化与糖尿病冠状动脉病变关系的研究[D];山东大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 马春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介导巨噬细胞极化效应对动脉粥样硬化作用的研究[D];福建医科大学;2015年

2 张译丹;盐皮质激素受体拮抗剂调控巨噬细胞表型对实验性矽肺的作用[D];河北医科大学;2015年

3 卢文冉;HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学性状的影响[D];河北医科大学;2015年

4 李文建;载脂蛋白E影响巨噬细胞因子表达及分型的机制研究[D];河北医科大学;2015年

5 曹爽;高糖对巨噬细胞TLR4信号转导的调节作用[D];河北医科大学;2015年

6 宁程程;肿瘤相关巨噬细胞在子宫内膜癌雌激素敏感性中的作用及机制研究[D];复旦大学;2014年

7 高龙;PLD4在肿瘤相关巨噬细胞抑制结肠癌增殖中的作用研究[D];成都医学院;2015年

8 任虹;感染期子宫颈癌U14细胞荷瘤小鼠抑制巨噬细胞CCL5分泌的机制研究[D];河北医科大学;2015年

9 李美玲;双酚A对小鼠腹腔巨噬细胞极化影响的体外研究[D];安徽医科大学;2015年

10 刘琼;黄芪多糖影响巨噬细胞向脂肪细胞趋化的作用及机制研究[D];新乡医学院;2015年

，

本文编号：1470386