miR-125b靶向Smad4调控非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的相关性

发布时间：2018-02-08 11:04

  本文关键词： miR-b Smad 骨髓基质干细胞 分化 增殖　出处：《中国老年学杂志》2017年02期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：目的探讨miR-125靶向Smad4调控对非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的影响。方法培养人骨髓基质干细胞系HMSC-bm,将miR-125b模拟物(mimics)、miR-125b抑制物(inhibitor)和对照(miR-NC)转染到细胞内,qRT-PCR和Western印迹检测过表达对Smad4表达的影响,构建野生型和突变型的Smad4的3'-UTR荧光素酶报告载体,分别命名为Wt-Smad4和Mut-Smad4,将构建好的质粒做三组共转染,即Wt-Smad4与miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及miR-NC与miR-125b mimics,检测荧光素酶的活性;BMP-2诱导HMSC-bm分化,将miR-125b mimics和si-Smad4转染到分化的细胞内,以不转染的细胞作为参照,检测miR-125b靶向Smad4对细胞分化的影响;将miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC转染到对数生长期的HMSC-bm细胞系,胆囊收缩素(CCK)8检测过表达对细胞增殖的影响;将miR-125b mimics与pc DNA3.1-Smad4质粒共转染;miR-125b mimics;miR-NC组;miR-NC与pc DNA3.1-Smad4组转染到HMSC-bm细胞系,检测miR-125b靶向Smad4对细胞增殖和分化的影响。结果转染miR-125b mimics组Smad4的相对表达量显著低于miR-125b NC组,转染miR-125b inhibitor组Smad4的相对表达量显著高于miR-125b NC组(P0.01),Western印迹的检测结果与其一致,荧光素酶结果显示,Wt-Smad4与miR-125b mimics组荧光素酶活性显著低于miR-NC与miR-125b mimics组(P0.01),结果证实Smad4是miR-125b的靶基因;miR-125b mimics和si-Smad4组Runx2和Osterix mRNA表达量显著低于对照组(P0.01);CCK8检测结果显示,miR-125b mimics组在24 h、48 h、72 h 3个时间点细胞的增殖率显著高于对照组(P0.01),miR-125b inhibitor组在3个时间点的细胞增殖率显著低于对照组(P0.01);miR-125b靶向Smad4对细胞增殖分化的影响试验结果显示,miR-125b mimics组细胞增殖显著高于miR-NC组(P0.01),miR-125b mimics与pc DNA3.1-Smad4质粒共转染组细胞增殖显著高于miR-NC(P0.05),miR-NC与pc DNA3.1-Smad4组细胞增殖显著低于miR-NC组(P0.05),miR-125b mimics组和miR-125b mimics+pc DNA3.1-Smad4组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量显著高于miR-NC组(P0.01);miR-NC+pc DNA3.1-Smad4组细胞中Runx2和Osterix的mRNA相对表达量显著低于miR-NC组(P0.01)。结论 Smad4是miR-125b的靶基因,上调miR-125b促进细胞增殖,下调miR-125b减弱细胞增殖,miR-125b靶向Smad4调控HMSC-bm细胞增殖和分化。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of miR-125 targeting Smad4 regulation on osteogenic differentiation and proliferation of bone marrow stromal cells with non-traumatic femoral head necrosis. Methods Human bone marrow stromal cell line HMSC-bm was cultured and transfected with miR-125b mimic mimic miR-125b inhibitor and control group miR-NC. The effect of overexpression on Smad4 expression was detected by intracellular qRT-PCR and Western blotting. The wild-type and mutant Smad4 luciferase report vectors named Wt-Smad4 and Mut-Smad4 were constructed. The constructed plasmids were cotransfected into three groups: Wt-Smad4 and miR-125b mimicsMut-Smad4 and miR-125b mimics and miR-NC and miR-125b mimics. the luciferase activity of BMP-2 induced HMSC-bm differentiation. MiR-125b mimics and si-Smad4 were transfected into differentiated cells, and the untransfected cells were used as the reference to detect the effect of miR-125b targeted Smad4 on cell differentiation. MiR-125b mimicsmimiR-125b inhibitor and miR-NC were transfected into the HMSC-bm cell lines at logarithmic growth stage. MiR-125b mimics and PC DNA3.1-Smad4 plasmid were co-transfected into HMSC-bm cell line by co-transfection of miR-125b mimicstmiR-NC group and PC DNA3.1-Smad4 group. Results the relative expression of Smad4 in transfected miR-125b mimics group was significantly lower than that in miR-125b NC group, and the relative expression of Smad4 in miR-125b inhibitor group was significantly higher than that in miR-125b NC group. Luciferase activity in Wt-Smad4 and miR-125b mimics groups was significantly lower than that in miR-NC and miR-125b mimics groups. The results showed that Smad4 was the target gene of miR-125b, and the Runx2 and Osterix mRNA expression levels in si-Smad4 group were significantly lower than those in control group P0.01A CCK8. The proliferation rate of cells at three time points at 24 h and 48 h at 72 h was significantly higher than that at 3 time points in the control group P0.01mmiR-125b inhibitor group. The results showed that the cell proliferation rate of mimics group was significantly lower than that of control group P0.01MR-125b targeted Smad4 on cell proliferation and differentiation. The results showed that the cell proliferation rate of the control group was significantly higher than that of the control group P0.01MR-125b mimics group. The relative mRNA expression of Runx2 and Osterix in miR-NC group was significantly higher than that in miR-NC group and miR-125b mimics PC DNA3.1-Smad4 group. The relative expression of Runx2 and Osterix was significantly higher in the co-transfection group than in the co-transfection group of miR-NCU P0.05miR-NC and PC DNA3.1-Smad4 group. The relative expression of mRNA and Osterix was significantly higher than that in the miR-NC group P0.05miR-125b mimics group and miR-125b mimics PC DNA3.1-Smad4 group, and the mRNA relative expression of Osterix was significantly higher than that in the miR-NC group. The relative expression of Runx2 and Osterix in PC DNA3.1-Smad4 group was significantly lower than that in miR-NC group. Conclusion Smad4 is the target gene of miR-125b. Upregulation of miR-125b promotes cell proliferation and down-regulation of miR-125b attenuates cell proliferation. MiR-125b targets Smad4 to regulate the proliferation and differentiation of HMSC-bm cells.
【作者单位】： 嘉兴市武警医院骨三科;
【分类号】：R681.8

【参考文献】

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