TLR4调控的神经炎症在术后认知功能障碍发病机制中的作用

发布时间：2018-03-05 18:10

本文选题：TLR4　切入点：调控　出处：《南京医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：小胶质细胞是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中的天然免疫细胞,参与监测CNS的内环境变化,在接受大脑损伤信号后发生活化,具体表现为小胶质细胞改变细胞形态,迁移到受损的部位,出现不同程度的增生,合成并分泌多种免疫调节因子;也可以转变成具有高度吞噬作用的细胞,清除死细胞、蛋白沉积以及病原体等等。与其它胶质细胞不同,小胶质细胞与其他组织中的巨噬细胞来源于同一个细胞系,招募血液中的单核细胞进入中枢可以进一步影响中枢定居的小胶质细胞的活化,放大中枢神经炎症。大量研究表明,小胶质细胞活化能够影响神经元的功能,与术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)以及阿尔茨海默等多种神经退行性疾病的发生发展密切相关。POCD是指患者手术后出现的CNS的严重并发症,老年以及严重的手术创伤是POCD的两大主要危险因素。尽管目前POCD的确切病理机制仍不明确,但是大量的研究表明中枢神经炎症在POCD的发生发展中至关重要。近年来,本研究小组发现氯化锂(Lithium chloride,Li Cl)作为一种GSK-3β抑制剂和神经保护药物,可以减轻老年大鼠腹部探查术后的学习记忆能力下降。大量研究证明TLR4信号通路的活化可以导致大量的炎症介质的合成和释放,在体和离体的前期研究均发现Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)与中枢神经炎症以及神经退行性疾病甚至POCD的发生发展密切相关。作为重要的炎性细胞因子,S100钙结合蛋白A8(S-100 calcium binding protein A8,S100 A8)能够趋化中性粒细胞等进入炎症部位,参与多种炎症反应。近年来,多项研究表明S100A8作为TLR4的内源性配体,可以活化TLR4信号通路参与中枢神经炎症。然而,S100A8是否与TLR4/My D88(Myeloid differentiation factor 88,髓样分化因子88)通路存在相互作用,进而参与调控POCD相关的中枢炎症,仍需要进一步的研究。本研究工作的第一部分首先初步探讨了TLR4信号通路在Li Cl改善小胶质细胞活化中的调节作用,然后进一步观察了Li Cl对老年大鼠脾脏切除手术后认知功能下降的保护作用及其对TLR4信号通路以及小胶质细胞增生的影响;第二部分首先探讨了在小鼠胫骨骨折手术的模型中,TLR4信号通路的活化对海马小胶质细胞增生的调控在POCD发生发展中的作用(第一节);其次,在该模型中进一步研究S100A8对POCD的调节作用,以及S100A8与TLR4信号通路的相互作用对中枢神经炎症甚至POCD的影响(第二节)。第一部分氯化锂预处理可能通过抑制小胶质细胞表面TLR4的活化改善老年大鼠脾脏切除手术后认知功能的下降目的:探讨小胶质细胞表面的TLR4信号通路在Li Cl改善POCD中的作用。方法:⑴离体实验部分:首先使用1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激BV-2小胶质细胞,在体外模仿中枢神经炎症;进一步在LPS刺激小胶质细胞前预先给予细胞10 m M的Li Cl和/或者100 n M的TLR4小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA),PCR法检测LPS刺激4小时后所有的细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和TLR4表达。⑵在体实验部分:将老年大鼠随机分为4组:生理盐水组、腹腔注射Li Cl组、腹腔注射生理盐水后行脾脏切除手术组、腹腔注射Li Cl后行脾脏切除手术组,手术后24小时,采用Morris水迷宫和开场实验检测大鼠认知功能的改变;采用Elisa法检测大鼠血清和脑脊液中TNF-α和白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的变化;采用PCR法检测大鼠海马中TNF-α和IL-1β表达的变化;采用Western blot以及PCR法检测海马TLR4信号通路的变化;采用免疫组化标记CD11b检测大鼠海马小胶质细胞的数目。结果:小胶质细胞接受LPS刺激后TNF-α和TLR4的m RNA表达显著增加,Li Cl或者TLR4 si RNA预处理可以同时抑制LPS诱导的TNF-α和TLR4表达,联合使用Li Cl和TLR4 si RNA两种预处理后,再接受LPS刺激的小胶质细胞中TNF-α和TLR4的m RNA表达甚至可以降低到基础水平。在体实验部分,老年大鼠脾脏切除手术后认知功能下降,手术前连续7天预先给予老年大鼠2 m M/kg的Li Cl,不仅可以改善大鼠术后认知功能的下降,还可以抑制手术导致的血清、脑脊液以及海马中TNF-α和IL-1β的表达,降低术后海马CA1区CD11b+区域的面积。老年大鼠脾脏切除手术后海马中的TLR(1-9)中仅有TLR2和TLR4m RNA的表达显著增加,而Li Cl的预处理可抑制术后大鼠海马中TLR4/NF-κB(Nuclear factorκB,核因子κB)的活化。结论:TLR4信号通路参与Li Cl对神经炎症的改善;Li Cl可以抑制TLR4信号通路活化,改善LPS诱导的小胶质细胞活化以及术后外周和中枢的炎症,最终抑制POCD的发生发展。第二部分S100A8调控小鼠胫骨骨折手术后的认知功能障碍依赖于TLR4/My D88信号通路的活化第一节探讨TLR4对中枢小胶质细胞的调控在胫骨骨折手术导致的小鼠认知功能下降中的作用目的:研究、阐明TLR4信号通路的活化对海马小胶质细胞增生的调控在POCD发生发展中的作用。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受胫骨骨折手术以及手术后观察的时间点不同共分为5组:对照组和4个手术组(手术后6、12、24和48小时组),采用Y迷宫和开场实验检测手术后24小时小鼠认知功能的改变;采用PCR和Western blot分别检测小鼠手术后外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以及脾脏和海马中TLR4/My D88信号通路的表达。⑵进一步对TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自对应的背景小鼠进行胫骨骨折手术,同样分为5组,免疫荧光标记Iba-1检测手术后海马小胶质细胞的活化情况;流式细胞分析检测其中TLR4-/-小鼠以及背景小鼠手术后24小时中枢中来源于外周的骨髓源性巨噬细胞的数目变化,并采用Y迷宫和开场实验检测它们认知功能的改变。结果:C57BL/6野生型小鼠术后24小时出现焦虑以及学习记忆能力的下降,小鼠的PBMCs、脾脏以及海马中的TLR4/My D88分别从手术后6小时和12小时发生活化。从手术后12小时开始,野生型小鼠海马CA3区小胶质细胞明显增生活化,然而与各自对应的野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手术后海马CA3区小胶质细胞增生持续的时间缩短,Iba-1免疫阳性区域的面积减少。野生型小鼠手术后24小时,大脑中CD45hiCD11b+的细胞数目显著增多,然而,TLR4-/-小鼠手术后这种类型的细胞数目没有出现明显的变化,而且这种小鼠术后24小时在Y迷宫和开场实验中的表现也没有出现与野生型小鼠类似的下降。结论:TLR4信号通路的活化可以促进骨髓源性巨噬细胞进入中枢,促进中枢小胶质细胞的活化,参与调控POCD的发生发展。第二节探讨S100A8和TLR4之间的相互作用对中枢神经炎症以及POCD的调控目的:研究S100 A8对POCD的调节作用,以及S100A8与TLR4信号通路的相互作用对中枢神经炎症甚至POCD的影响。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受胫骨骨折手术以及手术后观察的时间点不同共分为5组:对照组和4个手术组(手术后6、12、24和48小时组),采用PCR和Western blot分别检测小鼠手术后PBMCs、脾脏和海马中S100A8和S100A9的表达。⑵在C57BL/6野生型小鼠进行胫骨骨折手术前60分钟,分别对小鼠腹腔注射100μg S100A8的抗体或者等体积的生理盐水,采用Y迷宫和开场实验检测手术后24小时小鼠认知功能的改变;免疫荧光标记Iba-1检测海马小胶质细胞的增生活化情况。⑶分别对TLR4-/-小鼠以及野生型小鼠腹腔或者侧脑室注射S100A8蛋白,采用流式细胞分析检测所有的小鼠PBMCs和海马小胶质细胞中的TLR4活化;免疫荧光标记Iba-1检测手术后海马小胶质细胞的活化情况。⑷对TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自对应的背景小鼠进行胫骨骨折手术,同样分别分为上述5组,采用Western blot检测小鼠手术后脾脏和海马中S100A8和S100A9的表达。结果:在手术后6小时至24小时,甚至48小时内,野生型小鼠的PBMCs、脾脏中的S100A8和S100A9表达显著升高;从手术后12开始到术后48小时,野生型小鼠海马中S100A8和S100A9表达显著升高。S100A8的抗体可以明显抑制野生型小鼠手术后24小时海马中的小胶质细胞增生,改善小鼠术后认知功能。野生型小鼠手术后脾脏中表达的S100A8的同时呈现TLR4阳性。腹腔或者侧脑室注射的S100A8蛋白可以活化野生型小鼠PBMCs和海马中的CD11b+细胞表面的TLR4,促进海马小胶质细胞的增生。然而与野生型小鼠相比,腹腔注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海马中小胶质细胞的增生明显减少,而侧脑室注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海马中没有出现显著的小胶质细胞增生。另外,与对应的手术后野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手术后外周和中枢中的S100A8和S100A9的表达显著减少。结论:S100A8促进中枢小胶质细胞的活化,参与调控POCD的发生发展。S100A8和TLR4之间相互调控促进中枢炎症以及POCD的发生。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614

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