血清noncoding-RNA对非小细胞肺癌与乳腺癌的诊断价值及miR-574-5p与乳腺癌细胞转移相关性研究

发布时间：2018-03-07 21:11

本文选题：非小细胞肺癌　切入点：乳腺癌　出处：《北京协和医学院》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,全球每年约180万新发病例,约150多万人死亡,其中以男性居多。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%以上,部分患者发现时已处于中晚期,5年生存率较低。因此非小细胞肺癌的早期诊断显得尤为重要。目前,影像学检查是临床工作中主要的诊断工具,但其费用高,辐射较大等因素导致其不适合于大规模的筛查工作。故而我们急需找到检查便利、费用低而且创伤性小的检查手段。近年来,non coding RNA在肿瘤学领域中的重要性得到了广泛的研究,并且作为NSCLC的分子诊断标志物得到了越来越多的关注。本研究中,首先通过文献筛选出11种与非小细胞肺癌密切相关的non coding RNAs,包括niR-21, miR-197, miR-1254, miR-574-5p, miR-125b, miR-155, miR-30d, miR-24, miR-182, miR-485-5p 与 MALAT1,采用qRT-PCR技术,在试验组中对11种non coding RNAs进行筛选,并将5种表达差异显著的non codingRNAs在验证组中进行进一步的验证,构建NSCLC诊断模型。并应用ROC方法分析其诊断效率,结果显示,由此5种non coding RNA组成的NSCLC诊断模型的诊断效率较高,在试验组与验证组中AUC值分别为0.915与0.875。尤其是在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期的诊断效率较高。乳腺癌则是严重威胁着女性生命健康的主要疾病。每年新发乳腺癌病例约167万,约52万死亡。Non coding RNA不仅在肺癌中异常表达,也在乳腺癌血清中呈失调改变。为了找到有利于乳腺癌的诊断的分子标志物,我们构建了基于4种non coding RNAs的诊断模型。该模型在试验组与验证组中的AUC值分别为0.960与0.968。基于此模型对BC的诊断效率、敏感性及特异性均较高,可以作为BC诊断的分子标志物。基于前期的研究结果得知,miR-574-5p在乳腺癌患者血清中异常高表达,并且其诊断效率、敏感性与特异性均较高,在乳腺癌的临床诊断方面具有重要意义。因此,本节中进一步探讨miR-574-5p在乳腺癌患者血清中的诊断价值及其在乳腺癌细胞中的表达改变及其对乳腺癌发生发展中的作用机制。结果显示,miR-574-5p在正常对照组、纤维腺瘤组及乳腺癌患者组血清中的表达水平随病程的进展而呈现出逐渐升高趋势；miR-574-5p影响乳腺癌细胞的运动能力；并且与B-myb与MALAT1的表达水平存在关联；miR-574-5p靶向调节Snai3, Snai3是Snail家族中的一员,参与了肿瘤细胞的迁移过程。因此,提示miR-574-5p可能参与调控了乳腺癌细胞的迁移过程。以上结果提示我们miR-574-5p在乳腺癌的发生发展及侵袭转移等方面发挥了重要作用,并为其在乳腺癌的临床诊疗及防治领域的应用提供理论依据。肺癌是由小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组成,后者包括除小细胞肺癌以外的其他上皮癌,如腺癌、鳞癌、腺鳞癌、大细胞癌等,约占所有肺癌的80%以上。大部分患者发现时已处于中晚期,5年生存率较低。因此肺癌的早期诊断显得尤为重要。MicroRNA (miRNA)与长链非编码RNA MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)都是非编码RNA的组成部分,并且作为NSCLC的分子诊断标志物得到了越来越多的关注。本研究首次构建了基于多种血清miRNA 与 MALAT1的诊断模型,验证其作为NSCLC分子标志物的诊断效率。首先设计两阶段的病例对照研究来建立NSCLC诊断模型,将2002年收集的NSCLC血清样本与正常对照血清样本随机分成试验组(36例NSCLC vs 36例正常对照)与验证组(120例HSCLC vs71正常对照),并通过文献筛选出与NSCLC发生发展密切相关的长链非编码RNAMALAT1和10种niRNAs,包括miR-21, miR-197, miR-1254, miR-574-5p, miR-125b, miR-155, miR-30d, miR-24, miR-182, miR-485-5p。并应用qRT-PCR技术,在试验组中对11种non coding RNAs进行筛选,并将表达差异显著的noncoding RNAs在验证组中进行进一步的验证。通过危险分数分析法、ROC曲线、聚类分析等统计学分析建立基于血清non coding RNAs 的 NSCLC诊断模型。结果显示,在试验组中,NSCLC与正常对照组相比,5种non coding RNAs(miR-21, miR-1254, miR-485-5p, miR-574-5p 与 (MALAT1)的表达水平呈现显著差异。危险分数分析结果表明,基于此5种血清non coding RNAs建立的NSCLC诊断模型可以很好的将NSCLC与正常对照组区分。ROC曲线结果显示,在试验组与验证组中AUC分别为0.915(95%可信区间(CI)0.853-0.978)和0.875(95% CI0.819-0.930)。基于此5种血清non coding RNAs建立的NSCLC诊断模型与NSCLC的临床分期相关,其在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期的诊断效率较高。结论,本研究首次构建了基于多种血清niRNA与长链非编码RNA MALAT1的非小细胞肺癌的联合诊断模型,并且此模型对NSCLC的诊断效率、敏感性及特异性均较高,可以作为NSCLC的分子诊断标志物。乳腺癌(breast cancer, BC)是严重威胁女性生命与健康安全的主要疾病,其发病率呈每年升高趋势,而且日趋年轻化。乳腺癌患者的预后与肿瘤的临床分期密切相关,因此,乳腺癌的早期诊断与早期治疗至关重要。目前,临床上常用X线检查,超声检查,核磁共振及核医学检查来诊断早期乳腺癌。但是影像学检查费用高,辐射量较大,并不适用于乳腺癌的早期筛查工作。我们需要诊断效率、敏感性与特异性更高的检查手段,以避免不必要的影响学检查。血液non coding RNA分析就是一种创伤小而且花费小的筛查工具,有利于对大规模高风险人群进行筛查。本研究首次构建了基于多种血清miRNAs 与 MALAT1的诊断模型,验证其作为乳腺癌标志物的诊断效率。首先设计两阶段的病例对照研究来建立BC诊断模型,将2013-2014年收集的乳腺癌血清样本与正常对照血清样本随机分成试验组(30例BC vs 30例正常对照)与验证组(128例BC vs 77正常对照),并通过文献筛选出与BC发生发展密切相关的长链非编码RNA MALAT1和10中 miRNAs,包括miR-21,let-7a, miR-574-5p, miR-155, miRNA-10b, miRNA-181b, miRNA-1254, miRNA-196a, miRNA-205, miRNA-195。并应用qRT-PCR技术,在试验组中对11种non coding RNAs进行筛选,并将表达差异显著的non coding RNAs在验证组中进行进一步的验证。通过危险分数分析法、ROC曲线、聚类分析等统计学分析建立基于血清noncoding RNAs的BC诊断模型。结果显示,在试验组中,BC与正常对照组相比,4种non coding RNAs (let7a, miR-155, miR-574-5p 与 MALAT1)的表达水平呈现显著差异。危险分数分析结果表明,基于此4种血清non coding RNAs建立的BC诊断模型可以很好的将BC与正常对照组区分。ROC曲线结果显示,在试验组与验证组中AUC分别为0.960(95%可信区间(CI)：0.864-1.000)和0.968(95% CI0.903-0.985)。并且此4种non codingRNA在正常对照组、纤维腺瘤组与乳腺癌组间均存在差异性表达,联合let-7a、miR-155及miR-574-5p3种non coding RNA可以将纤维腺瘤与正常对照组区分开AUC值为0.987；而联合niR-155、miR-574-5p与MALAT1可以区分开乳腺癌与纤维腺瘤,AUC值为0.959。而且此4种non coding RNA在乳腺癌术前与术后1周的血清中,其表达水平也发生的明显改变。并且,对化疗前后的乳腺癌患者血清的研究发现,miR-155对化疗药长春瑞滨的敏感性更好。结论,本研究首次构建了基于多种血清miRNA与长链非编码RNA MALAT1的乳腺癌的联合诊断模型,危险分数功能分析表明基于此模型对BC的诊断效率、敏感性及特异性均较高,可以作为BC诊断的分子标志物。乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,发病率与死亡率均居各种恶性肿瘤前列,且呈逐年上升趋势,严重威胁着女性的生命健康安全。乳腺癌的发生发展是涉及多因素的复杂过程,深入研究乳腺癌的发病机制,找到有助于临床诊断与治疗的靶基因,将会大大改进乳腺癌防治工作并且对乳腺癌的早期诊断与预防具有重要的临床意义。miRNA是近年来研究最为广泛的非编码单链小RNA,大量研究指出,miRNAs在多种肿瘤中都存在表达失调现象。基于第二部分的研究结果,可以看到miR-574-5p在乳腺癌患者血清中异常高表达,并且其诊断效率、敏感性与特异性均较高,在乳腺癌的临床诊断方面具有重要意义。因此,本节中,将进一步探讨miR-574-5p在乳腺癌患者血清中的诊断价值及其在乳腺癌细胞中的表达改变及其对乳腺癌发生发展的影响,期待为乳腺癌的发生发展及侵袭转移等机制研究提供新的视角,为miR-574-5p在乳腺癌的临床诊疗及防治领域的应用提供理论依据。方法：1、采用q RT-PCR技术分析1niR-574-5p在正常对照组、纤维腺瘤组及乳腺癌患者组血清中的表达水平及其临床分期等因素的相关性。2、利用transwell方法分析miR-574-5p对乳腺癌细胞迁移的影响；并采用qRT-PCR技术分析miR-574-5p表达量的改变对乳腺癌细胞转移相关基因的影响。3、通过生物信息学在线预测软件分析miR-574-5p的靶基因；检测乳腺癌患者血清中niR-574-5p表达水平的与其预测靶基因Snai3基因表达的相关关系。结果：1、miR-574-5p在正常对照组、纤维腺瘤组及乳腺癌患者组血清中的定量分析结果显示,miR-574-5p在三组间的表达水平随病程的进展而呈现出逐渐升高趋势,并且三组间的差异性表达存在明显的统计学意义。2、转染miR574-5p mimic的MCF-7细胞,其迁移能力降低了2倍；而转染miR574-5p inhibitor后,细胞的迁移能力升高了1.94倍；并且组间统计学差异显著；在转染niR-574-5p mimic组中,Snail、E-cadherin、Snai3及MALAT1的表达量与对照组相比未见明显差异,p0.05,而B-myb的表达量显著下调,p=0.005。而转染miR-574-5p inhibitor组,Snail与MALAT1的表达量显著升高。3、生物信息学预测1niR574-5p的靶基因为Snai3;在乳腺癌患者血清中,miR-574-5p与Snai3基因间的表达水平存在负相关。结论：1、miR-574-5p可能在乳腺癌的发生发展过程中发挥了重要作用,并且可能会在乳腺癌的临床诊断中具有广阔的应用前景。2、体外的迁移实验表明,miR-574-5p影响乳腺癌细胞的运动能力；并且与B-myb与MALAT1的表达水平存在关联。3、miR-574-5p可能靶向调节Snai3,Snai3是Snail家族中的一员,参与了肿瘤细胞的迁移过程。因此,提示miR-574-5p可能参与调控了乳腺癌细胞的迁移过程。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2;R737.9

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