hTERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关蛋白表达的影响

发布时间：2018-03-08 04:23

本文选题：端粒酶反转录酶　切入点：基因转染　出处：《天津医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:以逆转录病毒PLXSN为载体,将h TERT基因转染入体外培养的大鼠雪旺细胞,检测雪旺细胞端粒酶活性及细胞生物学特性的影响。进一步探讨h TERT基因修饰雪旺细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤区神经修复相关相关白表达的检测及对神经功能恢复的影响。方法:体外培养大鼠雪旺细胞,经逆转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶(h TERT)基因转染雪旺细胞,体外培养Wistar大鼠雪旺细胞,经逆转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶(h TERT)基因转染,分为3组:对照组、阴性转染组、h TERT转染组。用RT-PCR,Western blot检测雪旺细胞在转染前后h TERT基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。成年雌性Wistar大鼠71只,造模成功66只,随机分为对照组,SCs组,h TERT-SCs组,22只/组,按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。分别于造模前、造模后1天、3天、1周、2周、3周、4周通过BBB评分、斜板试验、改良的Tarlov评分进行运动功能评定。造模后72 h通过RT—PCR、Western blot检测脊髓损伤区周围AQP4/9、MMP9/2基因转录和蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周,HE染色及荧光显微镜观测PKH-26标记的SCs存活及分布情况,通过免疫组化法检测GFAP、Nogo及NF200的表达量,行HRP示踪观察神经纤维再生情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果:通过逆转录病毒PLXSN介导的h TERT基因转染大鼠雪旺细胞后,转染h TERT后,h TERT转染组与对照组、阴性转染组相比h TERT基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多。各组间有统计学差异(p0.05)。RT-PCR,Western blot检测显示转染h TERT基因的大鼠雪旺细胞体外能表达h TERT;大鼠下肢运动功能评价h TERT-SCs组优于SCs组,SCs组优于对照组。造模后72小时h TERT-SCs组细胞凋亡指数均明显低于对照组(p0.05).造模后72小时,与对照组相比h TERT-SCs组AQP4/9基因和蛋白表达均较显著降低(p0.05)。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。SCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,h TERT-SCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。PKH-26标记的阳性细胞数:h TERT-SCs组最多,SCs组次之,对照组最少,且各组之间差异有统计学意义(p0.05)。造模后4周,h TERT-SCs组胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF-200)的表达较对照组明显升高,差异有显著性意义(p0.05),h TERT-SCs组Nogo蛋白的表达较对照组明显降低,差异有显著性意义(p0.05),HRP阳性神经纤维数:h TERT-SCs组最多,SCs组次之,对照组最少,各组之间差异有统计学意义(p0.05)。SEP和MEP的潜伏期:h TERT-SCs组SCs组对照组,且各组之间差异有显著性意义(p0.05);波幅:h TERT-SCs组SCs组对照组,且各组之间差异有显著性意义(p0.05)。结论:通过转录病毒PLXSN为载体介导端粒酶反转录酶(h TERT)基因转染使雪旺细胞端粒酶活性明显升高,能够促进体外培养的大鼠雪旺细胞增殖。h TERT基因修饰雪旺细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,降低脊髓损伤区周围AQP/9、MMP9/2基因转录和蛋白的表达和神经细胞凋亡,促进胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF-200)的表达的升高,降低Nogo蛋白的表达,改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【参考文献】