HDACi对大鼠急性马尾神经压迫损伤保护作用的实验研究

发布时间：2018-03-11 06:16

本文选题：HDAC　切入点：i　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景马尾神经综合征(CES)病程发病急、致残率高,一直作为腰椎疾病的一大难题难以攻破。马尾神经因其特殊的解剖结构,生理上易受到机械性损伤,并且一旦临床上出现鞍区感觉缺失、肠道功能紊乱以及性功能障碍等恶化症状后,手术治疗预后效果很差,多数患者残留有膀胱或肛门括约肌的功能障碍,给患者及其家属带来沉重的精神压力和经济负担。目前临床上采用的药物对症治疗和手术方法均未取得良好效果,临床研究少有突破。因此,寻求一种新的有效治疗马尾神经损伤的方法显得尤为重要。核小体中,组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)共同调节组蛋白的乙酰化水平,维持组蛋白乙酰化稳态。由于与基因的转录、表达、抑制和细胞的增殖、分化关系密切,HDAC已经作为肿瘤靶标在临床中得到广泛应用。同时,随着广大学者对HADC及HDACi的深入研究发现,除肿瘤领域外,HDACi对中枢神经系统的疾病也有治疗效果。已有研究证实了组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的神经保护作用,它影响着突触活性和神经元的功能。但目前关于HDACi应用于马尾神经损伤的研究尚未见相关报道。本项研究在以往实验基础上构建并改进了大鼠马尾神经压迫损伤的模型;其次将HDACi经皮下注入急性马尾神经压迫损伤的大鼠体内,以期恢复组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的平衡状态,调节基因转录障碍,从而达到保护马尾神经功能的目的;最后,应用RNA-seq研究大鼠马尾神经压迫损伤给予HDACi治疗后转录组基因表达变化,通过分析数据,探究其深层次的分子机制,期望从中发现HDACi对于马尾神经压迫损伤保护作用的作用靶点。研究目的建立并改进大鼠马尾神经压迫损伤的模型;证实HDACi对大鼠急性马尾神经压迫损伤的保护作用;利用RNA-seq手段研究大鼠马尾神经压迫损伤给予HDACi治疗后转录组基因表达变化,通过分析数据,探究其深层次的分子机制,为进一步研究马尾神经损伤保护修复机制提供实验基础,以期在马尾神经综合征的治疗中开拓新的研究方向。研究方法1、选取20只出生6周左右、体重约250克的实验SD大鼠,随机分为3组:模型组,n=8;假手术组,n=6;对照组,n=6。模型组大鼠在L4处咬除椎骨背脊,用电钻在咬除部位钻一1.2mm小孔,钻透椎板,将一长10.0mm、厚1.1mm、宽1.0mm的硅胶条沿小孔置入椎管远端,压迫l5及l6段马尾神经。假手术组仅在l4椎板上钻孔,未置入硅胶条。模型建立3天后,运用马尾神经压迫损伤模型的bbb评分、斜板实验评分判定各实验组动物行为学改变。在术后设置时间点取材,运用he染色、lfb染色、tunel染色、免疫荧光组织染色判定各实验组动物的组织病理学变化,确定模型建立成功。2、选取30只出生6周左右、体重约250克的实验sd大鼠,随机分为3组:实验组(注入vpa组),n=10;对照组(注入生理盐水组),n=10;假手术组,n=10。设计在实验组和对照组两组每只大鼠l4椎板上钻孔,并置入硅胶条,假手术组仅钻孔,不置入硅胶条。实验组术前2h经皮下注入vpa(300mg/kg),造模后实验组给予vpa(300g/kg,2/d),对照组注入等量生理盐水。在大鼠造模前2h及术后连续7d采集大鼠bbb评分、斜板试验评分。在术后7d,取大鼠的马尾神经组织进行免疫荧光染色、he染色和lfb染色,取大鼠的背根神经节(drg)组织进行tunel染色,取大鼠受损马尾神经近段的脊髓圆锥组织进行tunel染色。3、借助于最新的高通量测序技术,rna-seq来检测实验组与对照组对应节段马尾神经组织的基因表达差异,通过分析数据,初步找到与hdaci保护马尾神经压迫损伤作用机制高度相关的关键分子和信号通路。结果1、成功地建立并改进大鼠马尾神经压迫损伤模型。2、本次研究中,检测动物模型行为学的bbb评分、斜板实验评分结果提示,vpa注入后,实验组的下肢运动功能较对照组有明显的改善,组织病理学结果提示,实验组马尾神经的神经纤维华勒变性和脱髓鞘病变明显减轻,免疫荧光组织染色可以观察到实验组较对照组髓鞘化增多。tunel染色发现,实验组中脊髓前角细胞神经元和drg神经元细胞凋亡数量明显减少。3、通过分析大鼠马尾神经压迫损伤应用hdaci治疗后的差异基因表达及初步验证,筛选出hdac11,il18,fgf1,fgf5等差异表达基因,其中hdac11在vpa作用后存在高表达,il18在vpa作用后表达下降,fgf1在vpa作用后存在高表达,fgf5在vpa作用后存在表达下降。通过目前通用的keggpathway富集分析,发现了以下一些高度相关信号通路:mapk-jnk、p38mapk、calciumchannel、grb2-ras-mapk-erk、neuroactiveligand-receptorinteraction。结论本实验所建立的大鼠马尾神经压迫损伤模型设计合理、方便操作、可复制性强。能够真实有效地模拟引起马尾神经损伤的临床常见致病因素-腰椎间盘突出的致病过程。hdaci对大鼠急性马尾神经压迫损伤起到一定的保护作用,它可以改善马尾神经压迫损伤后的运动功能障碍、减少神经元凋亡、促进神经损伤后轴突再生。因此,HDACi是一种具有重大潜力的可配合临床减压手术有效改善患者预后功能的药物治疗措施。通过RNA-seq进行生物信息学分析和初步验证,结合KEGG Pathway富集分析,我们筛选出了与HDACi保护马尾神经压迫损伤的作用机制高度相关的关键分子及信号通路:HDAC11,IL18,FGF1,FGF5,MAPK-JNK、p38MAPK、calcium chanel、GRB2-Ras-MAPK-Erk、Neuroactive Ligand-Receptor Interaction。这些发现帮助我们加深对马尾神经损伤病理机制及HDACi保护马尾神经压迫损伤作用机制的理解,将成为我们下一步深入研究的方向,希望可以找到高效治疗马尾神经损伤的关键作用靶点,开发精准分子治疗手段,造福广大马尾神经综合征患者。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.5

【参考文献】