HO-1基因修饰的BMMSCs对减体积移植肝保护作用的研究

发布时间：2018-03-16 05:19

  本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：血红素加氧酶-1　出处：《天津医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:通过建立大鼠50%减体积肝移植排斥模型,检测载有血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞(BMMSCs)形成的HO-1/MSCs对减体积肝移植排斥模型受体的保护作用,同时探讨其可能机制。研究方法:(1)BMMSCs的体外培养及扩增采用密度梯度离心联合贴壁筛选法,在倒置显微镜下观察其形态,流式细胞术鉴定其表型,染色法检测其转化为脂肪和成骨细胞的能力。将载有HO-1基因的重组腺病毒载体感染至BMMSCs,构建HO-l/MSCs,荧光显微镜观察其转染率。(2)建立稳定的大鼠原位、50%减体积、30%减体积肝移植排斥模型,观察各组术后1、3、7和14d存活率,分析死亡原因。检测外周血清中的ALT、AST及TBIL水平;光镜观察移植肝脏组织病理学改变和排斥反应分级。(3)冰切片技术检测HO-l/MSCs在肝脏内分布情况;将50%减体积肝移植排斥模型分4组:①生理盐水处理组(NS组);②HO-1组;③BMMSCs组;④HO-l/MSCs组。观察受体术后临床表现、存活时间,计算存活率率;测肝重,计算肝再生速率;免疫组化染色观察增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平,计算PCNA指数;ELISA法测外周血清肝细胞生长因子(HGF)水平。(4)模型和分组同前,检测外周血清中的ALT、AST及TBIL水平;光镜观察移植肝脏组织病理学改变和排斥反应分级;透射电镜下观察移植肝脏组织的超微结构改变;ELISA法检测各组大鼠在各时间点外周血清IL-10、TGF-β、IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α的水平;流式细胞术测定外周血清调节性T细胞(Treg)水平。研究结果:(1)细胞贴壁生长成熟后,主要为长梭形,部分可以为漩涡或菊花状排列,具备BMMSCs典型形态特征。流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果显示:CD29、CD90和RT1A阳性率分别为97.50%、93.30%和96.70%,CD34、CD45和RT1B阴性率均99%。染色法结果显示:油红O染色示胞浆内出现红色脂滴,Von Kossa染色示细胞中出现黑色钙盐。构建HO-l/MSCs 48h后,细胞绿色荧光阳性表达率大约85%。(2)观察受体鼠存活率及肝体积结果:原位组1、3、7和14d存活率分别为91.20%、86.50%、81.10%和75.70%;50%减体积组移植肝占全肝百分比为:(49.30士1.43)%,1、3、7和14d存活率分别为85.00%、80.00%、62.50%和45.50%;30%减体积组移植肝占全肝百分比为(31.20士1.74)%,1、3、7和14d存活率分别为65.00%、50.00%、35.00%和17.50%。30%减体积组1、3、7和14d存活率与原位组及50%减体积组分别相比,都降低,存在统计学差异(P0.05)。外周肝功能(ALT、AST及TBIL)水平:30%减体积组分别与原位及50%减体积组相比较,都降低,存在统计学差异(P0.05)。各组术后7d病理均显示存在中到重度排斥反应。(3)HO-l/MSCs在肝脏内分布、受体大鼠存活率及肝再生情况:冰切片显示HO-l/MSCs在移植肝脏内分布密集。NS、HO-l、BMMSCs和HO-l/MSCs组受体大鼠的中位生存时间分别为13、15、25和38d;HO-l/MSCs组与其他三组相比,存活率提高,均存在统计学差异(P0.05);BMMSCs组与NS、HO-l组相比,存活率提高,均存在统计学差异(P0.05)。HO-l/MSCs组与其他三组相比,术后3、5、7和14d肝再生速率、PCNA指数以及外周血清HGF水平均升高,存在统计学差异(P0.05);BMMSCs组与NS、HO-l组相比,同样升高,存在统计学差异(P0.05)。(4)观察HO-l/MSCs对50%减体积肝移植排斥模型的免疫调节作用:①本部分各组术后受体一般情况及存活率比较结果同第三部分。②肝功能的结果:各组ALT水平从术后即刻升高,3h达到最高峰后下降,3d降到最低,后又有所升高,5d后又降低;AST水平除在6h达到最高峰以外,其余均同ALT;各组TBIL水平从术后即刻开始缓慢升高,5d时急剧升高,直到14d;以上肝功指标,HO-l/MSCs组与其他三组分别比较,除0h外各个时间点均显著降低,存在统计学差异(P0.05);BMMSCs组与NS、HO-l组分别比较,也是除0h外在各个时间点降低,存在统计学差异(P0.05)。③病理结果显示:NS、HO-l组病理表现基本相似,术后急性排斥反应进行性加重,第7d呈现中到重度急性排斥反应,不同之处在于急性排斥程度稍轻。BMMSCs、HO-l/MSCs组病理表现基本相似:7d内仅表现为轻度排斥反应,7d后排斥反应急剧加重;不同之处在于BMMSCs组14d时与NS组相比排斥反应稍轻,而HO-l/MSCs组则仍比NS组轻,差异明显。按Banff标准进行排斥反应程度分级,HO-l/MSCs组明显低于其他三组,存在统计学差异(P0.05);BMMSCs组除14d外均低于NS、HO-l组,存在统计学差异(P0.05)。④细胞因子检测显示:与其他三组相比较,HO-l/MSCs组中IL-10与TGF-β显著升高,IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α显著降低,存在统计学差异(P0.05)。⑤Treg检测结果显示:各组外周血清Treg水平比较,也有与肝脏病理和细胞因子相同的趋势。研究结论:(1)体外采用密度梯度离心联合贴壁这一方法分离、纯化以及扩增BMMSCs是简单可行的,所获细胞在形态学具有BMMSCs典型特点,表型鉴定结果也符合BMMSCs表型特点,同时其还能被诱导分化成为脂肪细胞和成骨细胞,这些就证明所获细胞即为BMMSCs。在此基础上,可以构建形成稳定的HO-1/MSCs,为后续实验奠定基础。(2)建立的减体积肝移植排斥模型稳定,并选定50%减体积肝移植排斥模型作为后续实验研究模型。(3)与单纯BMMSCs相比,HO-1/MSCs能更好地发挥促进减体积肝移植术后移植肝再生的作用,并且通过影响HGF水平发挥促进肝再生作用。这就为HO-1/MSCs用于临床促进肝再生方面提供了实验基础以及理论依据。(4)与单纯BMMSCs相比,HO-1/MSCs能更好地发挥免疫调节作用,对减体积肝移植排斥模型的移植物有更好的保护作用,这就为HO-1/MSCs用于临床抗肝移植术后免疫排斥方面提供了实验基础和理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3

【共引文献】

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本文编号：1618503