甲酰基肽受体和Ⅱ型胶原活化NSCs和BMSCs促进脊髓损伤修复的体外研究

发布时间：2018-03-22 05:37

  本文选题：甲酰基肽受体　切入点：神经干细胞　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是脊柱外科的严重疾病之一,年轻人发病多由于车祸等暴力损伤,而老年人发病多由于退变的颈椎间盘突出压迫。损伤后常出现截瘫、下肢神经功能障碍甚至死亡。由于脊髓自身的神经细胞再生能力有限,SCI发生后各种治疗效果都显得十分苍白。椎间盘内髓核组织主要由软骨细胞和细胞外基质Ⅱ型胶原构成。和神经细胞一样,软骨细胞也存在自身增殖能力有限的缺点。椎间盘在变性后几乎无法修复,从而失去力学支撑,突出在椎管内对脊髓产生压迫。目前以手术减压为代表的治疗方法无论因暴力还是椎间盘突出所导致的脊髓压迫都只能提供间接的治疗,无法达到满意的恢复效果。因此干细胞移植成为一种用于治疗SCI的新手段。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有增殖、迁移以及分化成神经元、星形胶质细胞和(或)少突胶质细胞等功能,作为SCI后细胞移植治疗用的主要载体。而骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)定向分化为软骨组织和细胞的能力,使其成为对椎间盘变性以及软骨缺损的细胞移植治疗用的主要载体。但在细胞移植后,干细胞的增殖、分化、迁移等转归问题还有很多因素无法确定,成为束缚细胞移植治疗效果的瓶颈所在。本文在体外通过甲酰基肽受体(formylpeptide receptors,Fprs)和Ⅱ型胶原的作用下研究对SCI相关干细胞即NSCs和BMSCs的增殖、分化、迁移的影响,为SCI相关干细胞移植治疗提供基础理论支持。第一部分：Fprs对NSCs的增殖、迁移和分化的作用在中枢神经系统损伤的病理状态下,NSCs可以远距离的迁移到损伤部位,发挥特定的生物学效应,对损伤起到了一定的修复作用,但是NSCs如何迁移、到达局部后如何定向分化为功能性神经元,其机制仍不明了。炎症细胞易于通过趋化因子受体而迁移,NSCs是否也通过趋化因子受体而迁移?Fprs属于G蛋白偶联受体,主要在天然免疫和炎症反应方面发挥重要作用,是经典的趋化相关受体,主要表达于单核和中性粒细胞上,也表达于肝脏等其他组织,近来被发现同样表达于中枢神经系统如脑组织和脊髓组织中。但Fprs和NSCs之间是否有关联目前尚未见报道。我们根据文献回顾的结果,设想Fprs和NSCs有关联,并通过免疫荧光、蛋白印迹等方法检测出NSCs能够表达Fprl和Fpr2。根据Fprs表达于NSCs的结果,通过Fprs的激动剂和阻断剂检测其对NSCs的功能和发挥的生物学效应,发现Fprs可以促进NSCs向神经元方向分化,并且能够促进NSCs的迁移。本研究可加深Fpr1和Fpr2对内源性NSCs的迁移和分化作用的认识,为细胞移植治疗中枢神经系统损伤如脑缺血和SCI开启了一个全新的窗口。目的：探讨甲酰基肽受体在体外对大鼠神经干细胞的增殖、分化及迁移的作用。方法：体外提取并培养原代NSCs,对其性状进行鉴定。分不同干预组(Fpr1激动剂和阻断剂、Fpr2激动剂和阻断剂)和空白对照组,分别作用于NSCs3d后,采用CCK-8法检测各组对NSCs活性的影响；免疫荧光法检测不同组处理NSCs后,各组与空白对照组相比,DCX、GFAP、Olig2蛋白表达量的差异；蛋白印迹(Western Blotting, WB)法检测不同组处理NSCs后,各组与空白对照组相比,DCX蛋白表达量的差异；形态学观察和transwell法检测,不同组处理NSCs后,各组与空白对照组相比,细胞迁移数量的差异。结果：(1)通过免疫荧光和WB法验证了Fpr1和Fpr2存在于NSCs上；(2)通过免疫荧光和WB法验证了Fprl和Fpr2的激动剂(fMLF和MMK-1)可促进NSCs向神经元方向分化；(3)通过形态学观察和transwell法验证了Fprl和Fpr2的激动剂(fMLF和MMK-1)可促进NSCs的迁移；(4)通过CCK-8法验证了Fprl和Fpr2对NSCs的增殖无影响。第二部分：Ⅱ型胶原对BMSCs分化为软骨细胞的作用椎间盘变性突出的主要原因是软骨细胞的变性和细胞外基质的水分丢失,随着年龄的增长,发病率随之增加。由于解剖结构的局限,软骨细胞缺乏直接的血运循环,损伤后自身修复或再生的能力非常有限。近年来越来越多的组织工程技术利用BMSCs的定向分化为软骨组织和细胞的能力,并以此构建为软骨组织和细胞用于对软骨缺损的治疗已在基础研究和临床应用方面都取得了极大的进展。但如何能够让其定向分化为软骨细胞并且发挥相关的生物学效应在现目前的研究中还是个热点和难点。Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ, col Ⅱ)可由软骨细胞分泌合成,具有亲和性强,能为软骨细胞的生长、增殖、分化及功能发挥近似于体内组织发生发育的细胞外基质作用的特点。研究表明Ⅱ型胶原在体内和体外均可促进BMSCs向骨细胞方向分化,并可促进骨缺损的愈合,但其作为软骨的细胞外基质对BMSCs向软骨细胞方向分化的研究少有报道,本实验以Ⅱ型胶原作为细胞外基质,体外研究Ⅱ型胶原对BMSCs向软骨细胞方向的分化作用,了解Ⅱ型胶原对BMSCs分化为软骨细胞的影响,以期Ⅱ型胶原作为仿生材料,用于损伤后软骨的修复研究提供实验依据。目的：探讨Ⅱ型胶原在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化作用。方法：体外原代提取并培养BMSCs,对其性状进行鉴定。分不同col Ⅱ接种浓度组(25、50、100、200μg/ml)和空白对照组,分别作用于BMSCs 7.14.21 d,采用CCK-8法检测各不同浓度组和时间点对BMSCs活性的影响；qPCR法检测不同浓度组处理BMSCs后,各浓度组与空白对照组相比,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA表达量的差异,免疫荧光法检测不同浓度组处理BMSCs后,各浓度组与空白对照组相比,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan蛋白表达量的差异。结果：(1)CCK-8检测结果显示各浓度组在7、14、21 d D(450)值差异无统计学意义；(2)qPCR检测方法显示21 d后,不同浓度组与空白对照组比较,Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA表达量均升高(p0.05),以100 μg/ml组最高(p0.01)；14 d时,各浓度组Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan mRNA以100 μg/ml组上调最明显(p0.05),而在7 d时,各组之间三者mRNA的表达差异无统计学意义(p0.05)；(3)各浓度组21天时免疫荧光结果显示：在100μg/ml组Collagen Ⅱ、SOX9及Aggrecan蛋白的表达量较其他各组均明显上调(p0.05)。综上所述：本文通过免疫荧光法、WB法首次证实了Fprl和Fpr2在NSCs上表达,并发现Fprl和Fpr2的激动剂可以促进NSCs的迁移以及向神经元方向的分化,而这种作用又可被其阻断剂所抑制。表明Fprs表达于NSCs上,并且在NSCs的迁移及分化中起到了重要的作用。通过不同浓度组colⅡ干预BMSCs 21d后,软骨细胞标志物(SOX9.Aggrecan及Collagen Ⅱ)mRNA水平和蛋白水平在100 μg/ml组增高最明显,表明col Ⅱ可促进BMSCs向软骨细胞方向分化。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 王钟;陈太邦;王永飞;郭乔楠;赵建华;;树突状细胞通过NT-3/TrkC信号通路调控神经干细胞存活的体外研究[J];第三军医大学学报;2013年12期

2 周广东,王晓云,苗春雷,刘天一,祝联,刘德莉,崔磊,刘伟,曹谊林;骨髓基质细胞修复猪膝关节非负重区软骨与骨复合缺损的实验研究[J];中华医学杂志;2004年11期

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本文编号：1647327