牛磺酸减轻椎板切除术后硬膜外纤维化的机制研究

发布时间：2018-03-22 14:47

本文选题：成纤维细胞　切入点：凋亡　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：椎板切除术是脊柱外科最为常用的手术方式之一,然而椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连严重影响了手术减压的效果,因此成为一直困扰着脊柱外科医生却没有得到很好解决的难题。因此,如何有效预防或减少椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连对于保证术后疗效显得尤为重要。既往研究已经证实,椎板切除术后硬膜外瘢痕的形成主要是由于局部成纤维细胞异常增殖、过度活化、胶原大量堆积等原因。因此,如何抑制成纤维细胞异常增殖和过度活化成为该领域研究的关键点。目前国内外在预防瘢痕粘连方面,主要进展包括:局部应用生物材料阻断成纤维细胞的浸润和聚集;局部应用抑制成纤维细胞的增殖的药物;局部应用促进成纤维细胞的凋亡的抗肿瘤药物(如丝裂霉素、他克莫司、雷帕霉素等);以流体或半流体样物质包裹手术区域的神经根和硬膜以及免疫治疗。我们分别研究了丝裂霉素C(MMC-C)和他克莫司(FK506)对硬膜外瘢痕粘连的作用。体内、外实验发现MMC-C和FK506均可有效抑制成纤维细胞增殖、胶原合成、促进成纤维细胞凋亡,从而显著地抑制了硬膜外瘢痕的形成。然而局部应用MMC-C、FK506对周围神经组织的产生的毒性作用,严重限制了这些药物的临床应用。因此我们急需寻找一种既可以有效抑制疤痕形成,又可以避免生物毒性作用的药物。牛磺酸(2-氨基乙烷亚磺酸)是一种哺乳动物体内极为丰富的氨基酸。是功能饮料中一种常见的添加成分。牛磺酸不仅具有调节渗透压、稳定细胞膜、调节神经传导等生物学作用,还可以保护细胞免受应激诱导的过氧化。近年来,国内外大量的研究表明牛磺酸可以抑制多个器官纤维化的病理过程。肝脏、肺、心脏等器官在发生纤维化时,最为重要的就是成纤维细胞的活化、增殖、胶原堆积等病理过程。我们通过建立椎板切除术的小鼠模型,局部和腹腔注射两个途径给予牛磺酸处理,发现牛磺酸可以显著抑制椎板切除术后硬膜外疤痕粘连,体外实验证实牛磺酸抑制成纤维细胞活化、增殖以及胶原形成的作用是通过下调EGR1实现的。第一部分:MMC-C通过内质网应激通路诱导脊髓损伤减压术后硬膜外瘢痕成纤维细胞凋亡目的:术后硬膜外瘢痕粘连会关系到脊髓损伤后减压手术的成败。有研究证实,术后局部应用丝裂霉素C可以有效减轻瘢痕粘连。术后瘢痕粘连与内质网应激通路诱导的细胞凋亡相关,但具体机制不明。方法:实验拟探讨丝裂霉素C对人硬膜外瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的作用机制,用丝裂霉素C(1,5,10,20,40 μg/mL)干预培养的人硬膜外瘢痕成纤维细胞,处理 12,24,48 h。结果:丝裂霉素C剂量、时间依赖性地抑制人硬膜外vR痕成纤维细胞生长。丝裂霉素C可显著提高细胞中促凋亡蛋白:Fas,DR4,DR5,cleaved caspase-8/9,Bax,Bim和cleaved-3表达,同时显著降低细胞抑制凋亡蛋白:Bcl-2和Bcl-xL的表达,但caspase-8/9抑制剂(Z-IETD-FMK和Z-LETD-FMK)并不能完全抑制丝裂霉素C诱导的细胞凋亡。同时,丝裂霉素C可剂量依赖性增加细胞中GRP78、内质网应激通路相关蛋白(CHOP)和caspase-4蛋白的表达,从而激发内质网应激。实验采用内质网应激抑制因子Salubrinal(Sal)可显著抑制丝裂霉素C处理后细胞活性,同时通过降低细胞内CHOP的表达而抑制凋亡。结论:结果证实,丝裂霉素C可部分地通过内质网应激通路诱导硬膜外瘢痕成纤维细胞的凋亡。第二部分:FK506通过CHOP通路激活内质网应激诱导成纤维细胞凋亡目的:增生性瘢痕(HS)源自于成纤维细胞凋亡减慢及其增殖加快。因此,成纤维细胞凋亡是发展HS新治疗策略的关键任务所在。既往报告显示,FK506能够减轻体内瘢痕的形成,且还能够诱导内质网应激(ER应激)。然而,FK506对ER介导的成纤维细胞凋亡的作用尚不明确。方法:本研究中使用的是大鼠皮肤成纤维细胞。利用细胞计数试剂盒Kit-8检测细胞活性,并通过膜联蛋白V/碘化丙啶双染色法检测细胞凋亡。然后利用小干扰RNA(siRNA)或慢病毒感染执行基因沉默。最后利用蛋白质印迹法(Western blot)测定细胞凋亡相关蛋白的表达,并通过免疫共沉淀法探索蛋白质之间的相互作用。结果:FK506能够显著减弱细胞活性,诱导成纤维细胞凋亡。有趣的是,FK506处理后还能激活ER应激。我们的研究进一步证实,通过激活CHOP而引发的ER应激能够调节FK506-诱导性细胞凋亡,这一点已通过利用TUDCA或CHOP沉默表达实现的ER应激后的细胞凋亡减慢得以证明。此外,免疫共沉淀结果表明,FK506处理诱导FKBP12.6从RyR2中解离,并从ER膜迁移至胞质液,进而加速了 ER应激介导的细胞凋亡。结论:FK506诱导的成纤维细胞凋亡可通过经CHOP信号通路的ER应激加以调节。第三部分:牛磺酸通过下调EGR1减轻椎板切除术后硬膜外纤维化目的:硬膜外纤维化是一种常见的椎板切除术后并发症,现已证明其与手术结果不佳密切相关。先前的研究表明,牛磺酸对肺和肝纤维化具有显著的抑制作用。我们进行这项研究为了考查牛磺酸对椎板切除术后模型大鼠硬膜外纤维化的影响,以及探讨其可能的分子机制。方法:对每只大鼠进行椎板切除术,建立硬膜外纤维化模型。牛磺酸处理后,使用Masson三色染色和免疫组织化学染色来检测硬膜外纤维化情况。使用细胞计数试剂盒测定细胞存活率。进行膜联蛋白V/碘化丙啶双染检测成纤维细胞的凋亡。采用微阵列检测mRNA的显著性变化。通过qRT-PCR测量mRNA的表达水平。通过慢病毒感染的方法建立相关蛋白稳定敲除和过表达的细胞系。通过蛋白质印迹测定纤维化相关蛋白的表达。结果:牛磺酸显著降低模型大鼠中椎板切除术诱导的硬膜外纤维化水平。然而,由于TGF-β及其受体的表达水平没有发生变化,证明牛磺酸的这种作用与TGF-β/Smad途径无关。另外,牛磺酸对细胞凋亡几乎没有影响。令人感兴趣的是,牛磺酸在在体和离体实验中均显著地降低EGR1(早期生长反应蛋白1,一种纤维化的促进因子)的表达水平。而且,EGR1的过度表达增强了成纤维细胞的活化,而敲除EGR1表现出相反的作用,这表明EGR1在牛磺酸对TGF-β诱导纤维化的抑制中发挥重要作用。结论:牛磺酸在在体实验中降低硬膜外纤维化和在离体实验中减少成纤维细胞的活化是由EGR1介导的。牛磺酸有望成为椎板切除术后硬膜外纤维化的潜在预防药物。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R687.3

【参考文献】