人椎间盘内N-Ac-PGP的鉴定以及其对软骨终板干细胞迁移和分化影响的研究

发布时间：2018-03-22 23:05

本文选题：椎间盘退变　切入点：椎间盘内稳态维持系统　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景及目的腰痛(low back pain, LBP)已经在世界范围内广泛流行,是导致劳动力丧失的主要疾病之一。椎间盘(Intervertebral disc,IVD)退变(Intervertebral disc degeneration, IDD)是LBP的一个重要的特异性致病因素。因此,预防、延缓或逆转椎间盘退变被认为是一种非常具有临床应用前景的治疗LBP的策略。然而,迄今为止,我们对椎间盘退变发病机制的了解还非常有限。最新的研究认为:椎间盘退变是一个由多种危险因素引起的,椎间盘细胞所介导的自身结构和功能逐渐破坏的过程,其发生和发展的关键环节是椎间盘内稳态维持系统的破坏。该系统主要由椎间盘内的体细胞和内源性干细胞组成。其中,具有自我更新和多向分化潜能的内源性干细胞被认为可以感受椎间盘内存活和功能细胞数量的减少以及椎间盘的结构损伤,然后迁移至损伤部位并分化为组织特异性细胞,从而维持椎间盘内存活和功能细胞数量的稳定,最终参与维持椎间盘结构与功能的内稳态。因此,椎间盘内的内源性干细胞的迁移与多向分化能力对于椎间盘结构和功能的内稳态至关重要。在我们的前期研究中,我们在人软骨终板中发现了可以成软骨、成骨和向髓核样细胞分力的干细胞,并命名为软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)。因此,我们推测CESCs在椎间盘内稳态维持系统中发挥着重要的作用。但是,我们对于CESCs迁移和分化机制的了解还非常有限。有证据表明,趋化因子及其受体是促使干细胞迁移的一个重要因素。然而,至今还没有研究去探讨椎间盘内促进CESCs迁移的趋化因子及其具体机制。另一方面,CESCs的分化方向是受到多种椎间盘微环境因素影响的,退变椎间盘内复杂的生物化学和物理微环境又是复杂而恶劣的。在退变微环境的影响下,迁移到损伤部位的CESCs是分化为具有“修复”功能的体细胞而发挥内稳态维持作用;还是发生“负面转化”而进一步破坏椎间盘的内稳态,这是一个值得深入探讨的问题。N-acetylted proline-glycine-proline (N-Ac-PGP)是一种由胶原蛋白降解产生的趋化因子,能够作用于中性粒细胞表面的CXCR1/2受体来趋化中性粒细胞,从而广泛参与到诸如急性肺部感染、慢性阻塞性肺病、炎性肠病、缺血性脑梗死等炎症性疾病中。然而,至今还没有研究去证明N-Ac-PGP是否存在于退变的椎间盘中,特别是在以胶原蛋白降解为主要病理学特征的退变髓核组织中。本研究的目的在于通过液相色谱质谱联用、ELISA和免疫荧光等实验方法明确人退变髓核组织中N-Ac-PGP的存在情况及其产生的分子途径,并通过体内外实验重点探讨N-Ac-PGP对CESCs迁移和分化的调控作用。本研究的实验结果可以为进一步阐明椎间盘退变的发病机制提供新的实验证据,同时,也为进一步完善基于干细胞的椎间盘再生修复的方法提供了新的理论依据。方法通过手术获取人体髓核组织标本,利用免疫组织化学染色,酶联免疫吸附实验和液相色谱质谱联用分析检测髓核组织中N-Ac-PGP生成相关蛋白酶和N-Ac-PGP本身的存在情况和浓度,并通过相关性分析明确椎间盘退变程度与髓核组织中N-Ac-PGP浓度的关系。对人髓核细胞进行原代培养,利用免疫荧光染色确定髓核细胞是否表达与N-Ac-PGP生成相关蛋白酶,并利用N-Ac-PGP的间接体内生成实验明确髓核细胞是否可以降解胶原蛋白生成N-Ac-PGP。接下来,对人CESCs进行原代培养,利用transwell迁移模型,荧光定量PCR,Western blot检测,免疫荧光染色,F-actin染色以及CXCR1/2的抑制实验去分析N-Ac-PGP对CESCs体外迁移的影响及其分子机制。基于家兔动物模型,将N-Ac-PGP以及CXCR1/2拮抗剂注射进入家兔腰椎间盘,然后利用HE染色方法观察N-Ac-PGP对软骨终板内细胞迁移的影响极其受体机制。另一方面,通过对家兔腰椎间盘切片进行免疫组织化学染色,明确受N-Ac-PGP诱导后向髓核迁移的细胞中的不同细胞类型。利用酶联免疫吸附实验,Western blot检测,实时定量PCR检测CESCs在N-Ac-PGP的作用下向髓核样细胞表型和促炎症表型的分化情况,明确N-Ac-PGP对CESCs分化的调控作用。结果1.人体髓核组织有N-Ac-PGP生成相关蛋白酶(MMP8, MMP9和PE)的存在。MMP8和MMP9的浓度随着椎间盘退变程度的加重而升高。2.人体髓核组织中N-Ac-PGP的浓度与椎间盘的退变程度呈正相关。3.人髓核细胞在体内和体外都表达MMP8, MMP9和PE。髓核细胞的条件培养基可以降解Ⅱ型胶原蛋白产生N-Ac-PGP,而且这种N-Ac-PGP的生成能力随着椎间盘退变程度的增加而增加。4. N-Ac-PGP可以显著促进CESCs的体外迁移。5. CESCs在细胞质和细胞膜上表达CXCR1和CXCR2。在N-Ac-PGP的作用下,CXCR1和CXCR2在CESCs中的表达显著上调。6. CXCR1和CXCR2的拮抗剂可以抑制N-Ac-PGP对CESCs体外迁移的促进作用。7. N-Ac-PGP促进CESCs中F-actin细胞骨架网络的合成与重排,并诱导CESCs伪足的形成,而这种作用可以被CXCR1和CXCR2的拮抗剂所抑制。8.向家兔腰椎间盘内注射N-Ac-PGP可以诱导软骨终板内细胞向髓核内迁移,这种迁移可以被CXCR1和CXCR2拮抗剂所抑制。迁移的细胞中有表达MT-MMP1和CD105的软骨细胞和表达MT-MMP1,CD105和Stro-1的梭型细胞。9. N-Ac-PGP抑制CESCs向髓核样表型分化,并诱导CESCs向促炎症表型分化。N-Ac-PGP的这种调控分化的作用也可以被CXCR1和CXCR2的拮抗剂所抑制。结论在椎间盘的微环境中,存在有由髓核细胞分泌MMP8, MMP9和PE级联分解胶原蛋白而产生的N-Ac-PGP。N-Ac-PGP的浓度与椎间盘退变程度密切相关。N-Ac-PGP是椎间盘微环境中的趋化因子,它能够结合CESCs的CXCR1和CXCR2来诱导其向髓核内迁移,从而促使CESCs向组织损伤部位迁移。然而,在N-Ac-PGP的作用下,CESCs向髓核样细胞的分化被抑制,导致CESCs在损伤部位不能正常发挥其对椎间盘结构和功能内稳态的促进作用。更严重的是,N-Ac-PGP还会促进CESCs向促炎症表型分化,这些促炎症细胞会进一步加重椎间盘微环境中的基质分解和炎症反应,从而加速椎间盘结构和功能内稳态的破坏,最终加速椎间盘退变的进程。抑制N-Ac-PGP的大量生成可能是提高退变椎间盘干细胞治疗的效率并促进椎间盘再生的新靶点。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.5

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