新型颈前路镁合金钢板对MG63细胞的增殖与成骨能力的影响

发布时间：2018-03-28 15:29

  本文选题：镁合金　切入点：生物相容性　出处：《郑州大学》2016年硕士论文

【摘要】：背景与目的颈椎前路椎间融合内固定术(anterior cervical discectomy and fusion,ACDF)长久以来一直是治疗颈椎疾病的传统术式。虽然前路固定钢板增强了颈椎稳定性,但诸如咽喉部异物感、吞咽障碍、钢板松动脱落甚至刺伤食管等内固定物并发症时有报道[1,2]。为了解除传统钛合金固定钢板的潜在危险,国内外越来越多的学者将目光转向生物可吸收材料的研究上。近年来镁合金因其在弹性模量、体内代谢方面的优势成为了新型内固定材料的研究热点。生物力学实验已经证实镁合金颈前路钢板与传统钛合金钢板具有相似的力学特性[3,4]。本研究参照国际标准ISO10993-5与ISO10993-12利用MG-63细胞进行体外细胞毒性实验,并观察MG-63细胞内Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,Col-1)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等成骨因子的表达变化以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性以探讨镁合金前路钢板的生物相容性以及其对成骨过程的影响。材料与方法按照ISO10993-12将Mg 2wt%Zn合金(由郑州大学材料科学与工程学院提供)制备成不同浓度的浸提液(未稀释时质量体积比为0.2g/ml)。MG-63细胞复苏后加入培养液,静置于37℃、5%CO2饱和95%湿度条件下培养。将实验分为2组,空白对照组:使用未处理的培养基;实验组:使用不同稀释倍数的镁合金浸提液培养基。观察细胞形态定期更换培养液。使用不同稀释倍数的浸提液处理细胞,于第1,2,3天采用CCK-8法检测各组内光吸收值(OD)以评估细胞增殖活性。在10倍稀释浓度浸提液处理后的第1、3、5、7、9天,以及不同稀释倍数的浸提液处理后第5天,采用可见光比色法测定细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。于干预后第5天裂解细胞利用BCA蛋白试剂盒测定细胞内蛋白总量。同时提取蛋白质与RNA并采用免疫蛋白印迹技术(western-blot)与实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR)检测目标蛋白Col-1、OC、OPN与相关RNA的表达量,评估镁合金对MG-63细胞成骨能力的影响。结果1各实验组CCK-8检测结果实验组在1x与2.5x稀释浓度条件下细胞生存率明显小于10x以上稀释浓度组,差异值有统计学意义(P0.05)。10x稀释浓度以上分组的细胞生存率与空白对照组差异值无统计学意义(P0.05)。根据CCK-8结果计算72小时IC50约等于5x稀释浓度。可推测出渗透压和镁离子浓度与细胞生存率呈负相关,即渗透压和镁离子浓度越高,细胞毒性越大。2各实验组ALP活性检测结果以不同稀释倍数的镁合金浸提液培养MG-63细胞1、3、5、7、9天后,随着培养时间延长,实验组与空白对照组的细胞内碱性磷酸酶表达均呈上升趋势,差异具有统计学意义(P0.05),且组内不同时间点碱性磷酸酶表达均有显著差异(P0.05)。同一时间点不同稀释倍数的碱性磷酸酶表达均有显著差异(P0.05)。镁合金浸提液对ALP的表达有抑制效应,且随着稀释倍数的增大该效应逐渐减弱。3各实验组蛋白总量检测结果在干预第5天时,不同稀释浓度组的蛋白总量均小于对照组,差异有统计学意义(P0.05),镁合金浸提液对蛋白总量的表达有抑制效应,且随着稀释倍数的增大该效应逐渐减弱。4各实验组成骨相关基因表达检测结果管家基因GAPDH及目的基因Col-1、OC和OPN m RNA的标准曲线可。各个检测基因均获得较好的Ct值,且样品重复性好。实验组Col-1、OC与OPN的m RNA的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。5各实验组Col-1、OC、OPN蛋白表达检测结果以不同稀释倍数的镁合金浸提液培养MG-63细胞,于第5天裂解细胞收集蛋白。利用蛋白印迹法(western blot)对细胞内Col-1、OC、OPN进行检测。通过图像分析软件对两组的图片进行分析。实验组Col-1、OC、OPN的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。这种促进效应随着稀释倍数的增高而逐渐降低(P0.05)。结论1.高浓度的镁合金浸提液对MG-63细胞的增殖有抑制作用;2.Mg-Zn合金可以促进MG-63细胞成骨因子(Col-1、OC、OPN)表达,可提高MG-63细胞的成骨能力。
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本文编号：1676917