活化性T淋巴细胞核因子5在烟雾吸入性急性肺损伤中的作用研究

发布时间：2018-04-01 09:13

本文选题：miRNA-155　切入点：吸入性肺损伤　出处：《河北北方学院》2017年硕士论文

【摘要】：据统计,约5%~10%烧伤患者并发吸入性肺损伤,重度死亡率可达80%以上,是早期烧伤患者主要的死因之一。虽然针对吸入性损伤的研究一直是国内外研究的热点,但其关键因素始终未能得到突破性进展,从而导致其死亡率居高不下。因此,对肺损伤的确切发病机制及有效的主动性干预措施的研究实属必要。研究发现,在急性肺损伤的发病机制中核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)有着重要作用。特异性抑制NF-κB信号通路的活化可减少炎症的级联放大,控制吸入性损伤的病变程度及减缓疾病进程。然而,由于NF-κB作用的时间和空间上的特异性,NF-κB信号通路的抑制剂尚未取得成功。微小RNA(microRNAs,miRNAs)技术的出现,为这一难题的解决提供了可能。miRNAs是具有调节作用小分子非编码RNA,能够与靶mRNA的3’非编码区特异性结合,介导翻译抑制或诱导降解,发挥转录后水平调控。miRNAs在抑制肿瘤细胞生长以及免疫方面的作用已经引起广泛关注,然而,关于miRNAs在烟雾吸入性急性肺损伤的相关功能研究鲜有报道。miR-155是miRNAs重要一员,在免疫及炎症方面具有重要的作用,但在烟雾吸入性急性肺损伤研究尚未见报道。活化性T淋巴细胞核因子5(nuclear factor of the activated T cell 5,NFAT5)属于Rel家族蛋白,因参与渗透压的调节而被大家所了解。此外,NFAT5还可诱导促炎因子的表达,促进炎症疾病的发生发展。因此,我们猜测既然炎症发生、发展与烟雾吸入性急性肺损伤有关,那么NFAT5是否也与烟雾吸入性急性肺损伤的发病机制有关?其相关研究国内外尚未报道。本实验采用大鼠烟雾吸入性急性肺损伤模型,在基因及分子水平对烟雾吸入性急性肺损伤的发病机制进行研究,探究:(1)NFAT5是否参与了烟雾吸入性肺损伤?(2)NFAT5功能的调控因子miR-155的筛选及功能验证。(3)NFAT5在烟雾吸入性急性肺损伤发病机制的作用。我们首先建立烟雾吸入性急性肺损伤大鼠动物模型,并通过miRNA芯片检测和表达谱芯片检测寻找出差异性表达的miRNAs和基因(miR-155和NFAT5)。通过体内及体外实验正反两方面研究NFAT5在烟雾吸入性急性肺损伤中的功能研究。具体的研究方法如下:1、烟雾吸入性急性肺损伤大鼠动物模型建立:使用自制烟雾吸入性损伤仪,建立大鼠烟雾吸入性急性肺损伤模型,通过肺组织HE染色、肺组织湿干比及COX2的Western blot进行验证;2、miR-155、NFAT5的筛选及相关分析:选烟雾致伤和正常大鼠各3只,烟雾致伤24小时后,对肺组织进行microRNA芯片检测和表达谱芯片检测(miRNA4.0芯片数据及RTA芯片数据),筛选出差异表达明显的miRNA及对应的靶基因;3、细胞水平对miR-155与NFAT5靶向关系的研究:利用生物信息学方法预测其靶基因;采用基因工程手段构建靶基因-荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶实验鉴定miRNA与靶基因mRNA 3’-UTR是否互补结合;4、miR-155功能的研究:将大鼠分为A:正常对照组:烟雾吸入性损伤组+安慰剂(生理盐水)、B:烟雾吸入性损伤组+miRNA-155control、C:烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 mimics、D:烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 inhibitors,转导治疗24小时后,通过病理HE染色、酶联免疫分析(ELISA)(炎症因子(Tumor Necrosis Factor-alpha(TNF-α)、monocyte chemotactic peptide-1(MCP-1)、(Interleukin-IL)-1β、IL-8))、实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)(TNF-α、IL-1β)、COX2的Western blot等方法研究miR-155是否能够减轻肺损伤及降低肺组织炎性分子的表达;5、NFAT5在烟雾吸入性肺损伤中的实验研究:对烟雾致伤组和正常对照组大鼠,行Western blot和RT-PCR检测NFAT5的表达情况;并对转导治疗中各分组行Western blot检测NFAT5、P-P65、P65、COX2的表达情况;最后对基因敲除小鼠和正常小鼠烟雾致伤后24小时,行病理HE染色和Western blot检测NFAT5、P-P65和COX2,进一步验证靶基因及相关通路蛋白在烟雾吸入性肺损伤中作用。结果:1、成功建立大鼠烟雾吸入性急性肺损伤动物模型:病理结果显示烟雾致伤组明显的炎细胞浸润、充血及肺泡改变;肺湿干比及COX2的灰度值均显示烟雾致伤组大于正常组,差异具有统计学意义(P0.01);2、miR-155、NFAT5参与烟雾吸入性急性肺损伤,且miR-155对NFAT5具有靶向调控趋势:miRNA芯片筛选得到了47个差异表达的miRNA具有统计学意义(P0.05),表达上调和下调的分别为24和23个,超过2倍显著差异表达的miRNAs包括:表达上调的miR-449a-5p、miR-205、miR-155-5p和表达下调的miR-92b-5p、miR-667-5p、miR-708-5p。上调的miRNAs中miR-155表达明显上调3.46倍;RTA芯片检测筛选得到共有30种基因差异表达具有统计学意义(P0.05),表达上调的有AKR1B10、CXCL13、VSIG4和表达下调的PLP2、SCD1、NFAT5、ATP6VB2等,且miRNA芯片和RTA芯片联合分析结果显示miR-155对NFAT5具有靶向调控趋势;3、miR-155对NFAT5基因mRNA 3’-UTR具有靶向调控作用:Mirbase、TargetScan、PicTar预测交叉结果显示,NFAT5基因3’UTR与miR-155存在结合互补位点;构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重组质粒经酶切及测序鉴定正确;双荧光素酶报告基因检测系统显示:pMIR-NFAT5+miR155 mimics组较pMIR-NFAT5+miR-control组荧光素酶活性降低,差异具有统计学意义(P0.01);4、miR-155能减弱烟雾致伤大鼠的肺损伤和全身炎症反应:病理检测结果显示烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 mimics大鼠肺组织的炎症充血、炎症细胞的浸润及肺泡结构破环程度较烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 control和烟雾吸入性损伤组+miRNA-155inhibitors明显弱,仅次于正常对照组;ELISA、Western blot、RT-PCR等证实了过表达miR-155可以减弱烟雾导致急性肺损伤相关蛋白COX2和炎症因子(TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-8)的表达(P0.05)。5、NFAT5加重烟雾吸入性急性肺损伤:Western blot和RT-PCR检测烟雾致伤组和正常对照组大鼠NAFT5结果显示烟雾致伤组的高于正常对照组,差异具有显著统计学意义(P0.01);烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 control、烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 mimics、烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 inhibitors三组大鼠肺组织标本Western Blot结果示烟雾吸入性损伤组+miRNA-155mimics大鼠肺组织NFAT5、P-P65、P65、COX2四种蛋白表达明显低于烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 control和烟雾吸入性损伤组+miRNA-155 inhibitors;NFAT5基因敲除小鼠和正常小鼠烟雾致伤后24小后,病理检测显示NFAT5-KO小鼠较正常鼠损伤明显减轻;NFAT5、P-P65和COX2等蛋白Western Blot结果显示NFAT5基因敲除组肺组织NFAT5、P-P65和COX2三种蛋白表达明显低于正常组(P0.01)。结论:1、NFAT5在烟雾吸入性急性肺损伤中发挥重要的生物学作用,其通过激活NF-κB信号通路加速病情进展;2、抑制NFAT5的表达能够减轻烟雾吸入性急性肺损伤;miR-155可负性调控NFAT5,从而减弱肺损伤;
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【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R644

【参考文献】