miR-124在乳腺癌骨转移中的作用及机制研究

发布时间：2018-04-02 11:37

本文选题：乳腺癌骨转移　切入点：微小RNA-124(miR-124)　出处：《第二军医大学》2015年硕士论文

【摘要】：【研究背景及目的】乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤。尽管随着诊断和治疗水平的发展,早期乳腺癌更容易得到诊断,并已有标准的治疗选择,生存率也有所提高。然而,晚期乳腺癌患者常发生局部进展或远处转移,目前仍无公认的治疗标准,生存期亦未得到显著改善。乳腺癌远处转移最常见的部位是骨。骨转移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓压迫等骨相关事件(skeletal related events,SREs),严重影响患者的生存质量和总体预后。目前,除了化疗、内分泌治疗和分子靶向治疗等全身治疗以及手术治疗和放疗等局部治疗以外,骨调节药物(bone modifying agents)因可发挥预防和治疗骨转移相关事件的作用,已在乳腺癌骨转移患者的治疗中占据重要地位。然而,骨调节药物并不能预防乳腺癌患者发生骨转移,亦没有证据证实其可延长患者生存时间。因此,深入研究发生乳腺癌骨转移的机制,寻找新的治疗靶点,将有助于进一步改善患者的生存质量,延长生存期。乳腺癌骨转移过程中,肿瘤细胞经过迁移、侵袭、粘附等环节到达骨微环境后,和骨微环境中的成骨细胞、破骨细胞、骨基质细胞之间产生复杂的相互作用,导致成骨/破骨平衡打破,形成了主要表现为溶骨性病变的病灶,引发骨相关事件。在以上过程中,许多发挥调控作用的基因或分子表达出现异常,可能成为新的作用靶点或诊断标志物,微小RNA(micro RNA,mi RNA)就是其中的研究热点之一。作为基因转录后调控的重要元件之一,mi RNA可通过作用于与乳腺癌发生发展相关的信号转导通路或骨微环境中的重要细胞因子或趋化因子促进或抑制乳腺癌骨转移的发生。作为内源存在的非编码双链RNA,mi RNA具有一定的组织特异性和分子靶向性,通过外源性调控相关mi RNA表达可能比传统的放化疗更安全,可能成为治疗乳腺癌骨转移的新手段,具有良好的应用前景。mi R-124最早在小鼠脑组织中被克隆,随后被证实在人胚胎干细胞中亦有表达。作为脑组织中表达量最高的mi RNA之一,已有许多研究表明mi R-124主要参与了神经系统的发育,其表达异常与多种神经系统疾病相关。近来有越来越多的研究关注mi R-124在恶性肿瘤发生发展中的作用。有研究表明mi R-124在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病等多种恶性肿瘤中表达异常,并通过靶向作用于多个癌基因发挥抑制肿瘤恶性生物学行为的作用。其中有数个研究证实mi R-124可抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示其在乳腺癌转移过程中发挥重要作用。但目前为止,关于mi R-124在乳腺癌骨转移中的作用尚未见报道。因此,本课题旨在明确mi R-124在乳腺癌骨转移发生中的作用,并初步探讨其作用机制,为乳腺癌骨转移的治疗提供新的靶点。【实验方法】一、mi R-124在不同骨转移能力乳腺癌细胞及小鼠乳腺癌骨转移组织中的表达1、比较正常乳腺组织和不同转移能力乳腺癌细胞中mi R-124表达分离正常小鼠乳腺组织,抽取RNA。培养不同骨转移能力的乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474,抽取细胞总RNA。Real-time PCR法检测以上组织和细胞中mi R-124的表达情况。2、检测并比较母代乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌骨转移组织中mi R-124表达小鼠左心室注射荧光素酶标记的MDA-MB-231制备乳腺癌骨转移模型。活体成像仪监测小鼠在体荧光信号。待发生骨转移后处死小鼠,留取骨转移组织,抽取RNA。Real-time PCR法检测以上组织和母代MDA-MB-231细胞中mi R-124的表达情况。3、检测人乳腺癌骨转移组织中mi R-124表达,分析其与患者无转移生存期关系收集5例乳腺癌患者原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织标本,原位杂交法检测mi R-124表达,比较各组表达差异。收集20例人乳腺癌骨转移标本,抽取总RNA,Real-time PCR法检测mi R-124的表达情况。通过随访了解患者从发现原发癌到发现骨转移灶的时间,即无骨转移生存期(Bone metastasis free survival),分析mi R-124表达与患者无骨转移生存期的相关性。二、体外调控乳腺癌细胞mi R-124表达对成骨细胞和破骨细胞的作用1、上调乳腺癌细胞mi R-124表达或抑制其作用对骨髓来源的巨噬细胞分化为破骨细胞的影响乳腺癌细胞MDA-MB-231转染化学合成的mi R-124拟似物(mi R-124 mimic)及阴性对照(negative control,NC)或mi R-124竞争性抑制物(mi R-124 inhibitor)及阴性对照(inhibitor NC),收取转染后48小时培养上清。从小鼠股骨分离骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)作为破骨细胞前体细胞,利用上述各组肿瘤细胞的培养上清培养BMM细胞,6天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色明确破骨细胞分化情况。2、改变乳腺癌细胞mi R-124表达对成骨细胞RANKL和OPG表达影响MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic及NC或mi R-124 inhibitor及inhibitor NC,转染后48小时收取上清。利用各组上清分别培养成骨细胞前体细胞株3T3E1细胞,6天后提取不同上清培养组3T3E1细胞的RNA,Real-time PCR法检测其中RANKL和OPG表达。3、上调乳腺癌细胞mi R-124表达对成骨细胞和破骨细胞相互作用的影响MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic及NC。上述各组乳腺癌细胞分别和3T3E1细胞共培养,3天后收集各组培养上清,利用该上清培养破骨细胞前体细胞株RAW264.7,培养3天后提取各组细胞的RNA,Real-time PCR法检测其中与破骨细胞分化相关的指标TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表达。三、初步探讨mi R-124在乳腺癌骨转移中的作用机制1、利用软件预测并筛选mi R-124与骨转移相关的靶基因利用Target Scan软件预测mi R-124靶基因,并筛选其中与骨转移相关的基因,发现白介素11(Interleukin 11,IL11)为其潜在靶基因。2、明确mi R-124对IL11表达的影响MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic或inhibitor,Real-time PCR法检测IL11m RNA表达,Western blot检测其蛋白表达。3、验证mi R-124与IL11 3′端非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)的靶向结合作用构建含有mi R-124结合位点的IL11 3′-UTR荧光素酶报告基因质粒及该位点突变的报告基因质粒,与mi R-124 mimic或NC共转染至HEK-293细胞,双报告基因试剂盒检测报告基因质粒荧光素酶活性,明确mi R-124是否可通过结合IL11 3′-UTR靶向调控IL11的表达。4、验证IL11和mi R-124在乳腺癌细胞及乳腺癌骨转移组织中表达的相关性(1)正常乳腺组织和不同转移能力乳腺癌细胞中IL11和mi R-124表达相关性Real-time PCR法检测正常小鼠乳腺组织和乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表达情况,分析其与mi R-124表达是否存在负相关。(2)母代乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌骨转移组织中IL11和mi R-124表达相关性Real-time PCR法检测MDA-MB-231细胞骨转移模型小鼠标本和母代MDA-MB-231细胞中IL11的表达情况,分析其与mi R-124表达的相关性。(3)人乳腺癌骨转移组织中IL11和mi R-124表达相关性收集5例乳腺癌患者原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织标本,免疫组化法检测IL11表达,分析其与mi R-124表达相关性。收集20例人乳腺癌骨转移标本,抽取总RNA,Real-time PCR法检测IL11的表达情况,分析其与mi R-124表达的相关性。四、统计学处理若无特殊说明,实验进行生物学重复3次,每次3个复孔。数据以X±SD,即均数±标准差表示,用SPSS17.0统计软件进行统计检验。方差齐性的两组之间比较采用student t检验(Student's t test),方差非齐性则采用非参数检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。通过统计检验计算P值,P0.05为具有显著性统计学差异。【实验结果】一、mi R-124在高转移性乳腺癌细胞及小鼠乳腺癌骨转移组织中的表达下调1、mi R-124在乳腺癌细胞中表达下调,且在骨转移能力较高的乳腺癌细胞株中表达较低Real-time PCR结果显示,与正常小鼠乳腺组织相比,乳腺癌细胞中mi R-124表达显著下调,且其在骨转移性较高的三阴(雌激素受体、孕激素受体和HER2均为阴性)乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436中表达较骨转移性低的细胞株MCF7、T47D、BT474低。2、小鼠乳腺癌骨转移组织中mi R-124表达下调小鼠左心室注射MDA-MB-231细胞制备乳腺癌骨转移模型。Real-time PCR结果显示,与母代MDA-MB-231细胞相比,小鼠乳腺癌骨转移组织中的mi R-124表达量显著下调。3、人乳腺癌骨转移组织中mi R-124表达下调,且其表达与患者无骨转移生存期相关原位杂交法检测乳腺癌患者原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织标本mi R-124表达,结果显示与原发癌旁组织相比,人乳腺癌组织中mi R-124表达明显减少,在骨转移标本中表达进一步减少。检测20例人乳腺癌骨转移标本中mi R-124表达并随访患者临床过程后发现mi R-124表达低者无骨转移生存期较mi R-124表达高者短。二、体外调控乳腺癌细胞mi R-124表达可直接或通过成骨细胞促进破骨细胞分化1、上调乳腺癌细胞mi R-124表达抑制BMM细胞分化为破骨细胞,抑制mi R-124作用促进BMM细胞分化为破骨细胞MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic或NC后收集上清培养BMM细胞,TRAP染色结果显示mi R-124 mimic组破骨细胞分化较对照组显著减少。反之,MDA-MB-231细胞转染mi R-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培养BMM细胞,TRAP染色结果显示mi R-124 inhibitor组破骨细胞分化较对照组显著增加。2、上调乳腺癌细胞mi R-124表达增加成骨细胞OPG/RANKL比值,抑制mi R-124作用降低成骨细胞OPG/RANKL比值MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic或NC后收集上清培养3T3E1细胞,Real-time PCR结果显示mi R-124 mimic上清组3T3E1细胞中OPG与RANKL比值增加。反之,MDA-MB-231细胞转染mi R-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培养3T3E1细胞,Real-time PCR结果显示mi R-124 inhibitor上清组3T3E1细胞中OPG与RANKL比值降低。3、上调乳腺癌细胞mi R-124表达抑制成骨细胞促进破骨细胞分化的能力MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic或NC后分别和3T3E1细胞共培养,收上清培养RAW264.7细胞,Real-time PCR结果显示mi R-124 mimic组上清培养的RAW264.7细胞中与破骨细胞分化相关的指标TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表达显著下调。三、mi R-124部分通过调控IL11抑制乳腺癌骨转移1、mi R-124抑制IL11 m RNA和蛋白表达MDA-MB-231细胞转染mi R-124 mimic或inhibitor,Real-time PCR结果显示mi R-124 mimic抑制IL11 m RNA表达,mi R-124 inhibitor增加IL11 m RNA表达;Western blot结果显示mi R-124 mimic抑制IL11蛋白表达,mi R-124 inhibitor促进IL11蛋白表达。2、mi R-124靶向结合IL11 3′-UTR构建IL11 3′-UTR荧光素酶报告基因质粒,与mi R-124 mimic或NC共转染至293细胞,双报告基因试剂盒检测结果显示mi R-124 mimic可抑制该报告基因活性;将IL11 3′-UTR上mi R-124结合位点突变,重复上述实验,双报告基因试剂盒检测结果显示位点突变后,mi R-124 mimic对报告基因的作用消失。以上结果提示mi R-124可通过结合IL11 3′-UTR靶向调控IL11的表达。3、IL11和mi R-124在乳腺癌细胞及乳腺癌骨转移组织中表达呈显著负相关(1)正常乳腺组织和不同转移能力乳腺癌细胞中IL11和mi R-124表达呈负相关Real-time PCR法检测正常小鼠乳腺组织和乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表达情况,相关性分析结果显示IL11与mi R-124表达呈显著负相关。(2)小鼠乳腺癌骨转移组织中IL11和mi R-124表达呈负相关Real-time PCR法检测MDA-MB-231细胞骨转移模型小鼠标本和母代MDA-MB-231细胞中中IL11的表达情况,相关性分析结果显示IL11与mi R-124表达呈显著负相关。(3)人乳腺癌骨转移组织中IL11和mi R-124表达相关性免疫组化法检测乳腺癌患者原发癌组织、癌旁组织和骨转移组织标本IL11表达,结果显示与原发癌旁组织相比,人乳腺癌组织中IL11表达明显增加,在骨转移标本中表达进一步增加。收集20例人乳腺癌骨转移标本,Real-time PCR及相关性分析结果显示其中IL11的表达与mi R-124表达呈显著负相关。【结论】一、mi R-124乳腺癌细胞和乳腺癌骨转移标本中表达下调,并与患者无转移生存期密切相关,提示其在乳腺癌骨转移过程中发挥重要作用。二、乳腺癌细胞中mi R-124可抑制破骨细胞分化和活化。三、mi R-124靶向调控乳腺癌细胞中IL11表达,可能为其抑制乳腺癌骨转移的分子机制。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【参考文献】