降钙素基因相关肽通过NLRP3途径抑制小鼠巨噬细胞系炎性激活实验研究

发布时间：2018-04-10 21:11

本文选题：降钙素基因相关肽 + 还原型辅酶II氧化酶-活性氧簇-NOD样受体蛋白3　；参考：《第三军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide,CGRP)是一种具有许多不同功能由神经分泌的多肽,许多实验研究表明,异常巨噬细胞活化和产生自身核酸的自身抗体是特征系统性红斑狼疮。有人建议雌激素可以自身反应性B细胞的增殖和刺激驱动M2巨噬细胞[1,2]。单核苷酸多态性(SNP)在干扰素调节因子5(IRF5),一个主要的非—SLE的HLA风险等位基因,已被证明有男性高频率[3]。IRF5最近为提高M1巨噬细胞分化[因此,它是可能的巨噬细胞差异男性和女性SLE患者的调节。炎症的多蛋白复合物含有核苷酸结合寡聚结构域(NOD)类似物在黑色素瘤细胞或缺乏2(目标),从而激活Caspase-1在刺激和促进IL-1β生产NOD样受体失调(NLR)PYRIN含蛋白3(NLRP3炎性体具有域)神经肽P物质降钙素基因相关肽分别包含11和37种氨基酸。它们经常被发现于感觉神经元,它们分泌量的增加通常来源于共同的刺激物。有各种研究表明神经肽可诱导巨噬细胞促炎性细胞因子的生产。降钙素基因相关肽可改善因缺氧导致的心肌细胞炎症和改善一氧化氮介导的心肌细胞凋亡。将H9c2心肌细胞暴露于缺氧的环境中2小时,以建立缺氧缺血的环境,炎性小体是一种高分子量的蛋白复合体。它形成于当细胞受到危险或被相关病原体侵袭时的胞浆中。研究中,我们使用不同浓度CGRP刺激静息状态下和LPS活化状态下的小鼠RAW264.7巨噬细胞,探讨CGRP对巨噬细胞炎性因子IL-1β,TNF-α分泌的影响及机制。研究方法:1.在体外培养巨噬细胞RAW264.7,让其生长于DMEM培养基(含10%FBS,1×105U/L青霉素,100mg/L链霉素)中,37oC,5%CO2条件下中培养,3-4d传代一次,传代比例为1:3。2.在小鼠巨噬细胞中加入含有不同浓度CGRP和/或LPS的DMEM培养液(LPS50ng/m L,CGRP 10ng/m L,CGPR 30ng/m L,CGRP 100ng/m L,CGRP30ng/m L+LPS50ng/m L)预处理。3.使用q RT-PCR扩增仪检测CGRP和/或LPS处理后的小鼠巨噬细胞IL-1β,TNF-α和NLRP3 m RNA表达水平4.采用小IL-1β肿瘤坏死因子,定量分析酶联免疫吸附测定试剂盒对CGRP和/或LPS处理后的小鼠巨噬细胞进行检测。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度CGRP和/或LPS处理小鼠RAW264.7细胞后,NLRP3,Caspase-1和Procaspase-1的蛋白表达水平。结果:1.细胞培养:经镜下观察巨噬细胞成圆形或/和椭圆形,贴壁生长,状态良好。2.在体外小鼠巨噬细胞培养基中CGRP和/或LPS2,小鼠巨噬细胞在含不同浓度(LPS50ng/m L,CGRP 10ng/m L,CGPR 30ng/m L,CGRP 100ng/m L,CGRP30ng/m L+LPS50ng/m L)培养液的条件下培养,3天后顺利提取RNA、蛋白,预备下步实验。3.q RT-PCR检测小鼠IL-1β、TNF-α、NLRP3m RNA,结果提示CGRP处理LPS活化和未活化巨噬细胞后,IL-1β、TNF-αm RNA分泌水平较空白对照组相比,均明显降低(P0.05),且成浓度依赖性。4.小鼠的IL-1β、TNF-αELISA试剂盒结果提示:CGRP(10ng/m L、30ng/m L,100ng/m L)处理后,IL-1β、TNF-αm RNA分泌水平与空白对照组相比,明显降低(P0.05),且成浓度依赖性。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度CGRP和/或LPS处理小鼠RAW264.7细胞后,NLRP3,Caspase-1蛋白表达水平和m RNA一致,Procaspase-1蛋白表达较对照组无明显变化。结论:1.本研究表明,CGRP抑制巨噬细胞炎性激活,其机制可能与CGRP抑制NLRP3表达与活性有关;2.LPS可刺激巨噬细胞,炎性因子分泌增加;3.CGRP能抑制巨噬细胞RAW264.7中NLRP3及Caspase-1活性,从而使IL-1β、TNF-α分泌减少,从而起到对炎症反应调节的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R68

【参考文献】