Neuregulin1在创伤性脑损伤中的保护作用及机制的研究

发布时间：2018-04-15 01:37

  本文选题：neuregulin1 + 脑创伤　； 参考：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）给患者遗留长期的神经功能缺损，导致进行性认知功能障碍，目前尚无有效的预防及治疗手段。机械性损伤对大脑产生初级损伤，而后继发出现包括兴奋性毒性、氧化应激、神经炎症、神经变性等二次损伤，扩大损伤效应。前几十年的TBI研究，主要着重于阐明神经元死亡（neuronal death），包括凋亡（apoptosis）、自噬（autophage）、坏死（necrosis）等分子机制。但是，近期越来越多的研究发现，除了神经元的损伤之外，胶质细胞反应及血管调控对TBI的预后至关重要。 在神经血管单元（the neurovascular unit, NVU）中，各个组成成分相互作用，建立了在解剖和功能上更加有效的一个整体。中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的神经元需要受到其所在的微环境的调节，才能发挥最强的功能，而调节这个微环境最为重要的一个因素，就是血脑屏障（blood brain barrier, BBB）。BBB的最主要成分为沿微血管管壁分布的内皮细胞，这些内皮细胞受NVU中其他细胞如星形胶质细胞（astrocyte）及足细胞（pericyte）的精细调控。 事实上，当TBI患者在重症监护室接受治疗时，主要治疗靶点为组成BBB之微血管的损坏。BBB的损伤，在急性期导致血管源性水肿，随之出现其下游的病理变化，包括脑血流及代谢的变化、缺氧/缺血、炎症、氧化应激及细胞死亡，导致脑水肿，引起颅内压增高。TBI后BBB功能的改变，加重毒性物质的堆积，更进一步影响认知障碍，加速大脑的老化。寻找对TBI的有效治疗手段，应致力于挽救NVU的完整性，改善各组成细胞之间的相互作用。 NRG1是一种内源性生长因子，在中枢神经系统发挥多种功能，且目前已作为治疗心力衰竭的三期临床实验用药。NRG1基因结构复杂，可以转录二十余种跨膜蛋白，产生大量组织及细胞特异性亚基。NRG1根据氨基末端序列，可以分为I、II、III型；而且还根据表皮生长因子样基团的不同，分为α或β型。NRG1的信号由ErbB家族受体酪氨酸激酶：ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4传递。NRG1/ErbB信号通路对胚胎期CNS发育和出生后脑功能非常重要。受体的结合可形成同型或异型二聚体，形成的二聚体激活内源性酪氨酸激酶，使受体磷酸化，激活下游的多种信号通路。 本课题组前期的研究发现NRG1预处理，可使TBI后认知障碍得到改善；TBI超急性期给予外源性NRG1，可降低BBB渗透性；NRG1能保护IL-1β导致的脑微血管内皮细胞屏障损伤。为了更进一步了解NRG1对TBI的神经保护作用，，尤其是NRG1对BBB的作用及机制，本课题进行了两部分研究： 第一部分Neuregulin1对青少年小鼠创伤性脑损伤恢复期的神经保护作用及机制的研究 目的：探讨外源性NRG1对青少年小鼠TBI恢复期的神经保护作用及机制。方法：①选用青少年小鼠，行脑皮质挫伤手术，建立TBI模型；随机分为NRG1治疗组和载体治疗组，皮下植入Alzet泵，连续给药2周。②在TBI恢复期，通过各种行为学检测手段评判感觉运动功能及认知功能。③通过组织学及免疫组织化学方法，比较NRG1治疗组与载体治疗组的脑损伤面积、神经元和抑制性神经元的数目改变及脑白质变化。结果：①TBI后恢复期，NRG1治疗组小鼠的NSS评分低于载体治疗组；Wire-grip评分高于载体治疗组,具有显著性差异（p0.05）。②TBI恢复期，NRG1治疗组小鼠，水迷宫实验中未见显著性差异；但Y迷宫NRG1治疗组优于载体治疗组，具有显著性差异（p0.05）。③NRG1治疗组创伤面积与载体治疗组未见显著性差别。④NRG1治疗组病灶同侧及对侧与载体组相比总神经元数量未见明显改变，但NRG1治疗组病灶对侧海马CA3区抑制性神经元数量明显增加，具有显著性差异（p0.05）。⑤NRG1治疗组病灶同侧损伤周围区脑皮质内轴突更长更粗，髓鞘结构更完整。结论：①NRG1有益于TBI后恢复期感觉运动及认知障碍恢复。②NRG1可增加TBI恢复期损伤对侧海马内抑制性神经元数量，保护脑白质。 第二部分Neuregulin1对脑微血管内皮细胞的保护作用及机制的研究 目的：利用IL-1β处理制备的脑微血管内皮细胞损伤模型，验证NRG1对内皮细胞功能的保护作用及机制。方法：①将原代培养人脑微血管内皮细胞或人脑微血管内皮细胞系，接种到细胞培养板中，待细胞达到80%~100%融合时，将不同浓度IL-1β加入内皮细胞中，同时加入NRG1或载体，处理不同时间。②通过LDH及MTT，检测NRG1对细胞的毒性及活性的影响。③通过跨膜电阻实验及Dextran渗透实验，检测NRG1对人脑微血管内皮细胞屏障功能的影响；同时通过Western Blot及免疫荧光染色方法检测NRG1对紧密连接蛋白及粘连蛋白表达及对细胞内骨架蛋白的影响，探讨其保护内皮细胞屏障功能的机制。④通过中性粒细胞粘附实验，检测NRG1对人脑微血管内皮细胞粘附功能的作用；同时通过Western Blot方法检测NRG1对粘附蛋白的表达，探讨其保护炎细胞粘附的机制。结果：①所用浓度IL-1β及NRG1没有引起LDH和MTT改变。②NRG1可降低IL-1β介导的Dextran渗透增加，增高TEER；NRG1可减低RhoA活性，抑制MLC磷酸化，稳定细胞骨架结构，具有显著性差异（p0.05）。③NRG1可减少IL-1β介导内皮细胞上中性粒细胞的粘附数量增加；减少ICAM-1、VCAM-1及E-selectin表达，具有显著性差异（p0.05）。结论：①NRG1可通过抑制RhoA激活，降低MLC磷酸化，稳定细胞骨架，保护IL-1β介导内皮细胞屏障功能损伤。②NRG1可通过减少细胞粘附分子的表达，减少IL-1β介导内皮细胞上中性粒细胞的粘附。
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本文编号：1751966