培美曲塞联合唑来膦酸对三阴性乳腺癌体内外抗肿瘤作用及相关机制的研究

发布时间：2018-04-18 23:06

  本文选题：三阴性乳腺癌 + 培美曲塞　； 参考：《中国人民解放军医学院》2015年博士论文

【摘要】：研究目的：研究培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌的体内外抗肿瘤作用效果及用药安全性；明确Mina53基因在三阴性乳腺癌中的表达情况及对其三阴性乳腺癌生物学行为的影响;探讨培美曲塞联合唑来膦酸对三阴性乳腺癌的协同抗肿瘤作用机制。研究方法：1)CellTiter 96(?) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay法检测培美曲塞、唑来膦酸对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生长抑制作用及筛选实验最适浓度,验证培美曲塞联合唑来膦酸对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生长是否有协同抑制作用；流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法及Annexin V-FITC/PI双染法检测培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的细胞周期及细胞凋亡的影响;Realtime-PCR方法检测培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax、Bcl-2基因的mRNA表达的影响。2)在裸鼠皮下建立三阴性乳腺癌异种移植瘤动物模型;通过用游标卡尺测量计算肿瘤体积的变化趋势,用小动物活体成像仪采集肿瘤自发荧光信号变化趋势来比较培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌的体内抗肿瘤作用效果;通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性;用免疫组化检测法观察培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对肿瘤组织中CD31、CDllb的蛋白表达的影响。3)Real time-PCR方法检测三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231-fLtic-GFP、Luminal型乳腺癌细胞系MCF-7、HER-2过表达型乳腺癌细胞系SK-BR-3及人类正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中Mina53基因的mRNA表达情况;Western bilt方法检测MDA-MB-231-fLue-GFP、MCF-7、SK-BR-3及MCF-10A细胞系中Mina53蛋白表达情况：利用RNA干扰技术siRNA-Mina53转染MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞,抑制其中Mina53基因的表达;用Rea1 time-PCR方法检测siRNA-Mina53的转染效率同时筛选siRNA-Mina53寸三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因表达的抑制的最佳转染浓度;Western bolt方法检测siRNA-Mina53的转染效率同时筛选siRNA-Mina53对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53蛋白表达抑制的最佳转染浓度；CellTiter 96(?) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay去检测-Mina53基因表达沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP增殖的影响;流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色及Annexin V-FITC/PI双染法检测Mina53基因表达沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞周期及细胞凋亡的影响;Transwell实验检测Mina53基因表达沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞迁移、侵袭能力的影响;细胞粘附实验检测Mina53基因表达沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLtic-GFP细胞粘附能力的影响;Real time-PCR方法检测Mina53基因表达沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2. VEGF.Bax.Bcl.2基因mRNA表达量的影响。4)Real time-PCR方法检测培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mina53基因mRNA表达量的影响;Western bolt方法检测培美曲塞、唑来膦酸及二者联合应用对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中Mjna53蛋白表达量的影响;免疫组化法检测培美曲塞、唑来膦酸及二者应用对三阴性乳腺癌组织中Mina53的蛋白表达的影响。研究结果：1)培美曲塞与唑来膦酸对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的生长均有抑制作用,而且抑制作用具有浓度依赖性,随着药物浓度的升高而增强；体外实验中培美曲塞对MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞的最适抑制浓度为10μmol/L,唑来膦酸对MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞的最适抑制浓度为100μmol/L,培美曲塞联合唑来膦酸组细胞活度较单独用药组明显降低(P0.05),且二者联合用药指数CI=0.3251,说明培美曲塞联合唑来膦酸对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖具有协同抑制作用;与对照组相比,培美曲塞、唑来膦酸、培美曲塞联合唑来膦酸均可使处于细胞周期亚G0/G1期与G0/G1期的MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞比例增加,但培美曲塞联合唑来膦酸应用使阻滞于G1期之前的细胞所占比例显著高于单独用药所占的比例(P0.001),同时联合用药组细胞增殖指数PI=0.51889,明显低于对照组及单独用药组;与对照组相比,培美曲塞组、培美曲塞联合唑来膦酸组细胞总凋亡率均显著增高(P0.01,P0.001),而唑来膦酸组细胞总凋亡率无明显增高(P0.05),但培美曲塞联合唑来膦酸组的总凋亡率高于培美曲塞组(P0.05);培美曲塞、唑来膦酸、培美曲塞联合唑来膦酸均可使三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的nRNA表达量降低,且联合用药组的表达量低于单独用药组CyclinD1 (P0.05)、MMP2 (P0.01)及VEGF (P0.05)。与对照组相比,培美曲塞组(P0.05)、培美曲塞联合唑来膦酸组(P0.001)可以显著提高Bax/Bcl-2比值,且培美曲塞联合唑来膦酸组的升高水平显著高于培美曲塞组(P0.001),但唑来膦酸组Bax/Bcl-2比值升高不明显(P0.05)。2)体内实验证实,至观察终点,与对照组相比,无论是培美曲塞、唑来膦酸单独用药还是二者联合用药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响;培美曲塞、唑来膦酸及二者联合用药均可对三阴性乳腺癌肿瘤生长起到抑制作用,培美曲塞联合唑来膦酸组对肿瘤体积的抑制率最高达到了86.942±3.695%,明显高于培美曲塞组的53.238±5.513%和唑来膦酸组的31.506±6.359%,两者之间比较差别均有显著的统计学意义(P0.001,P0.001),而且培美曲塞联合唑来膦酸组的肿瘤体积抑制率高于相同剂量的培美曲塞与唑来膦酸分别给药组的肿瘤体积抑制率之和;至观察终点时,培美曲塞组、唑来膦酸组及培美曲塞联合唑来膦酸组的肿瘤自发荧光信号强度均低于对照组(P0.05,P0.05,P0.01),且培美曲塞联合唑来膦酸组的肿瘤自发荧光信号强度也低于单独用药组(P0.05);实验中各组肿瘤组织免疫组化结果显示：培美曲塞、唑来膦酸均可抑制肿瘤组织中CD31蛋白的表达,二者联合用药后抑制作用更明显；唑来膦酸对肿瘤组织中CDllb蛋白表达有明显的抑制作用,培美曲塞对其抑制作用不明显,二者联合用药后抑制作用未见明显增强。3)与正常乳腺上皮细胞相比,Mina53在乳腺癌各亚型细胞系中的表达量均显著增高(P0.001),且三阴性乳腺癌亚型细胞系MDA-MB-231-几uc-GFP中Mina53的表达量均显著高于其它亚型乳腺癌细胞系(P0.001);siRNA-Mina53可有效转染至MDA-MB-231-几uc-GFP细胞,抑制细胞中Mina53的表达,且空白对照组 (正常 MDA-MB-231-fLuc-GFP 细胞) 与阴性对照组(siRNA-control-MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞)细胞中Mina53的mRNA及蛋白的表达量均无明显差别(P0.05),经过验证,脂质体：siRNA-Mina53=1：2比例配合的浓度为最适转染浓度,对细胞中Mina53表达的抑制效率最高；与对照组相比,siRNA-Mina53转染MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞靶向沉默Mina53基因表达后细胞增殖率自第48h开始显著降低(P0.001),被阻滞在亚G0/G1期与G0/G1期的细胞所占比例显著增高(P0.001),细胞总凋亡率显著增高(P0.001),同时,转染后细胞的迁移、侵袭及粘附能力均显著降低(P0.001)与对照组相比,siRNA-Mina53转染MDA-MB-231-fLuc-GFP细胞靶向沉默Mina53基因表达后的细胞中CyclinD1、MMP2及VEGF基因的mRNA表达量均显著降低, (P0.0001),但凋亡相关基因Bax、Bcl-2的mRNA表达量的比值(Bax/Bcl-2反应细胞凋亡相关基因的表达水平)显著增高(P0.001)。4)培美曲塞组、培美曲塞联合唑来膦酸组处理的MDA-MB-231-几uc-GFP细胞中Mina53基因的mRNA表达量均显著低于对照组(P0.001,P0.001),但在唑来膦酸组中降低不明显(P0.05),而且培美曲塞联合唑来膦酸组中Mina53基因mRNA表达量显著低于培美曲塞组(P0.001),在后续的不同药物处理组细胞及肿瘤组织中Mina53蛋白表达水平的检测中也得出了类似的结果。研究结论：1.体内外实验结果均证实：培美曲塞与唑来膦酸联合应用对三阴性乳腺癌具有协同抗肿瘤作用。且在一定的浓度范围内培美曲塞与唑来膦酸联合用药是安全的,荷瘤裸鼠对培美曲塞与唑来膦酸联合用药的耐受性良好,无严重的副作用发生。2.与正常乳腺上皮细胞相比,乳腺癌细胞中Mina53是高表达的。且Mina53在三阴性乳腺癌细胞中的表达水平高于其他亚型的乳腺癌细胞。靶向沉默Mina53基因能显著降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231-fLuc-GFP的增殖、迁移、侵袭及粘附能力,并对细胞中CyclinD1、MMP2、VEGF、Bax/Bcl-2的表达产生影响,提示Mina53有望成为作为三阴性乳腺癌的基因治疗靶点。3.培美曲塞联合唑来膦酸对三阴性乳腺癌的协同抗肿瘤机制可能为：培美曲塞可以抑制三阴性乳腺癌中Mina53的表达,而Min53表达水平的降低会引起三阴性乳腺癌中CyclinD1、MMP2、VEGF等表达水平的下调及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的mRNA表达量的比值(Bax/Bcl-2反应细胞凋亡相关基因的表达水平)升高,从而降低三阴性乳腺癌中肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及粘附能力,诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用;而唑来膦酸则是通过降低三阴性乳腺癌肿瘤细胞微环境中的CD11b阳性表达的M2型巨噬细胞的浸润,进而降低由其分泌和释放的MMP2和VEGF等因子的表达水平,从而直接或间接的影响细胞的增殖。培美曲塞与唑来膦酸联合用药后通过不同的作用机制起到了协同抗肿瘤的作用。4.初步推测唑来膦酸可能使三阴性乳腺癌肿瘤组织对培美曲塞作用的敏感性增高,从而提高培美曲塞的抗肿瘤作用效果,但具体的作用机制尚需进一步实验研究予以明确。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

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本文编号：1770479