神经细胞粘附分子（NCAM）对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用和机制研究

发布时间：2018-04-20 08:43

本文选题：骨关节炎 + 神经细胞黏附分子　；参考：《新乡医学院》2017年硕士论文

【摘要】：背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的关节变性疾病,以软骨外细胞基质成分被过度降解导致软骨进行性破坏为主要特点。由于软骨细胞属于终末分化细胞,自身的修复能力有限,破坏后很难再生,目前尚缺乏满意的治疗措施。骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)是一种多向分化潜能的成体干细胞,具有向软骨、成骨、脂肪、肌腱、韧带等分化的能力。BMSCs具有来源丰富、取材方便、增殖快、定向分化能力强等优点,逐渐成为软骨组织修复构建的最佳种子细胞来源之一。另外,神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)在骨髓间充质干细胞中目前已经被发现,并且NCAM可参与调控间充质干细胞分化。NCAM在BMSCs向软骨细胞分化过程中高表达,而其具体的调控作用及其机制却不完全清楚,本课题的目标旨在阐明NCAM对BMSCs向软骨细胞分化的作用和机制。目的1.研究神经细胞粘附分子(NCAM)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成软骨细胞分化是否有作用;2.通过软骨细胞分化前体细胞(ATDC-5)确定NCAM对软骨细胞分化的影响;3.研究NCAM对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨细胞分化的调控作用是通过哪些信号通路来影响的;4.研究NCAM与骨关节炎之间的关系。方法1.细胞的培养和分化,建立NCAM敲除的BMSCs(KO细胞)进行体外的研究。2.在正常(WT)和KO的BMSCs中加入软骨细胞诱导液分化0d、1d、3d、7d、10d、14d后,通过Western blot和qPCR方法分析NCAM敲除缺失后软骨细胞肥大的指标RunX2和ColⅩ的变化,茜素红染色研究钙沉积的变化。3.在ATDC-5细胞中转染NCAM干扰质粒,采用Western blot和茜素红染色的方法检测软骨细胞肥大的指标(RunX2和ColⅩ)以及钙沉积的变化,确定NCAM确实参与了软骨细胞的分化。4.在WT细胞中转染EMEK和在KO细胞中加入ERK激酶的特异性抑制剂U0126,采用Western blot、qPCR和茜素红染色的方法研究(RunX2和ColⅩ)以及钙沉积的变化,确定ERK信号通路参与软骨细胞分化。5.建立单碘醋酸盐(mono-iodoacetate,MIA)诱导的大鼠骨关节炎模型,提取关节软骨的组织蛋白,采用Western blot的方法检测NCAM在骨关节炎中的表达变化情况。6.通过在ATDC5细胞中加入interleukin(IL)-1β,建立细胞炎症模型,采用Western blot的方法检测在体外炎症环境条件下BMSCs向软骨细胞分化过程中NCAM的变化情况。7.在IL-1β诱导的ATDC5细胞中,过表达NCAM,采用Western blot和免疫荧光的方法检测软骨细胞肥大的指标RunX2和ColⅩ的变化情况。结果1.前期的研究显示,在正常的BMSCs中,随着软骨细胞分化天数的增加NCAM的表达量明显上调。因此,我们建立了NCAM敲除的BMSCs进行体外的研究。结果发现,当NCAM缺失后,软骨细胞肥大的指标RunX2和ColⅩ的表达量明显上调,并且茜素红染色颜色明显加深。这些结果说明,NCAM的缺失能促进BMSCs肥大(增生)的软骨细胞分化。2.为了进一步的确认NCAM缺失能促进增生的软骨细胞分化,我们在软骨细胞分化前体细胞ATDC5细胞中将NCAM沉默。结果发现NCAM干扰后能明显的促进肥大的软骨细胞分化。3.为了探究NCAM缺失促进肥大的软骨细胞分化的分子机制,我们对涉及的信号通路进行了探究。结果显示NCAM缺失后p-ERK的表达量明显上调;并且分别将ERK信号通路进行抑制或激活后,发现软骨细胞肥大的指标RUNX2和ColⅩ具有明显的下调或上调。说明NCAM缺失可能是通过ERK信号通路来促进肥大的软骨细胞分化。4.建立单碘醋酸钠诱导的大鼠骨关节炎模型,发现NCAM的表达量明显下调。另外,在ATDC5细胞中加入IL-1β在体外模拟骨关节炎的环境条件,结果发现当加入IL-1β后NCAM的表达量明显下调,而软骨细胞肥大的指标RUNX2的表达量明显上调。这些结果说明,NCAM的表达量在体内外的骨关节炎模型中都是下调的。5.为了进一步说明NCAM过表达后能否缓解骨关节炎的症状,我们在IL-1β诱导的ATDC5细胞中将NCAM进行过表达。结果发现,当NCAM过表达后,软骨细胞肥大的指标RunX2和ColⅩ明显下调。这些结果说明NCAM在骨关节炎中起着重要的作用。结论1.NCAM缺失具有促进肥大性软骨细胞分化的作用。2.ERK通路参与NCAM调控肥大性的软骨细胞分化。3.NCAM调控炎症诱导的肥大软骨细胞分化,提示NCAM在骨关节炎中起重要作用。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells ( NCAM ) were used to investigate the effects of NCAM on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSC ) . The results showed that NCAM deletion could promote the differentiation of hypertrophic chondrocytes . The results showed that the NCAM deletion could promote the differentiation of hypertrophic chondrocytes .

【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R684.3

【参考文献】